ICS 59.080.01 W40 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T32016—2015 蚕丝 氨基酸的测定 Silk-Determination of amino acids 2015-09-11发布 2016-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T32016—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国纺织工业联合会提出。 本标准由全国丝绸标准化技术委员会（SAC/TC401)归口。 限公司、苏州大学、江门出入境检验检疫局、杭州市质量技术监督检测院、广东出人境检验检疫局、浙江 省检验检疫科学技术研究院 本标准主要起草人：伍冬平、李天宝、吴淑焕、徐昊楠、孙道权、左保齐、湛权、刘雨、肖海龙、顾虎、 李淳、周颖、吴刚。 I GB/T32016—2015 蚕丝 氨基酸的测定 1范围 本标准规定了蚕丝中氨基酸成分及含量的分析测定方法 本标准适用于蚕丝中十八种氨基酸组分的测定。天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷 氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯 丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）采用酸水解法测定，胱氨酸 (Cys）和蛋氨酸（Met）若采用酸水解法不能准确测定、应采用氧化水解法测定，色氨酸（Trp）采用碱水解 法测定。其最低检出限均为10pmol。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6529 纺织品调湿和试验用标准大气 SAC GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3 方法原理 酸、碱水解法：蚕丝蛋白在高温酸性或碱性溶液中会发生水解，水解成的氨基酸可用离子交换色谱 法进行分离和测定。氧化水解法：蚕丝蛋白中含硫氨基酸（胱氨酸、蛋氨酸），用过甲酸氧化并经盐酸水 解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸矾，此两种产物可用离子交换色谱法分离和测定。 4试剂与材料 4.1要求 浓盐酸（12mol/L）为优级纯，其他试剂如无特别注明，均为分析纯。 4.2水 符合GB/T6682二级水要求 4.3 3氮气 纯度为99.99%。 4.4酸水解法 4.4.1 酸解剂：用水将浓盐酸稀释至6mol/L。 4.4.2冷冻剂：液氮、干冰乙醇或干冰内酮。 4.4.3 稀释上机用缓冲液：用水将浓盐酸稀释至0.02mol/L。 1 GB/T32016—2015 4.4.4不同pH和离子强度的洗脱用缓冲液与再生液（可按仪器说明书配制），配制方法如下： a)I pH=2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na:C.HsOz·2H2O）和16.5mL浓盐酸 加水稀释到1000mL，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至2.2； b)1 pH=3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用 浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.3； c）pH=4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓 盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.0； d)I pH=6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到 1000mL，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.4； RG再生液：称取8g氢氧化钠（优级纯）和100mL乙醇（色谱纯）加水稀释至1000mL。 e)l 4.4.5节三酮溶液（可按仪器说明书配制），配制方法如下： a）pH=5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH·H2O)168g，加人冰乙酸（优级纯）279mL，加 水稀释到1000mL，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至5.2； b）三酮溶液：取150mL二甲基亚矾（C,H.OS）和乙酸锂溶液50mL加人4g水和节三酮 (C.H,O：·H2O)和0.12g还原节三酮(CisHioO。·2H,O)。 4.4.6混合氨基酸标准储备液：含甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸等17种常规蛋白水解液 分析用色谱纯氨基酸，各组分浓度为2.50μmol/mL(或2.00μmol/mL)。 4.4.7混合氨基酸标准工作液：吸取一定量的混合氨基酸标准储备液（4.4.6）置于50mL容量瓶中，以 稀释上机用缓冲液（4.4.3)定容，混匀，使各氨基酸组分浓度为100nmol/mL。 4.5氧化水解法 4.5.1过甲酸溶液：将30%过氧化氢与88%甲酸按1：9的体积比混合，于室温下放置1h，置冰水浴中 冷却30min，临用前配制。 4.5.2氧化终止剂：48%氢溴酸。 4.5.3酸解剂：同4.4.1。 4.5.4稀释上机用柠檬酸钠缓冲液：pH=2.2，钠离子浓度为0.2mol/L。称取柠檬酸钠19.6g，用水溶 解后加人浓盐酸16.5mL,硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，最后加水定容至1000mL，用G4垂熔玻璃砂芯 漏斗过滤。 4.5.5不同pH和离子强度的洗脱用缓冲液与再生液：配制方法同4.4.4。 4.5.6节三酮溶液：配制方法同4.4.5。 4.5.7磺基丙氨酸-蛋氨酸标准储备液：准确称取色谱纯磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸砜113.3mg， 加水溶解并定容至250mL，磺基丙氨酸与蛋氨酸砜浓度均为2.50μmol/mL。 4.5.8磺基丙氨酸-蛋氨酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准储备液（4.5.7)1.00mL，置于 50mL容量瓶中，加稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.5.4)定容、混匀，使各组分浓度为50nmol/mL。 4.6碱水解法 4.6.1碱解剂：4mol/L的氢氧化锂或氢氧化钠溶液。可用水溶解167.8g氢氧化锂（LiOH·HzO)并 稀释至1000mL的方法制取，使用前取适量超声或通氮脱气。 4.6.2冷冻剂：同4.4.2。 4.6.36mol/L的盐酸溶液：配制方法同4.4.1。 4.6.4稀释上机用柠檬酸钠缓冲液：pH=4.3，钠离子浓度为0.2mol/L。称取柠檬酸钠14.71g、氯化 铵2.92g和柠檬酸10.50g，溶于500mL水，加人硫二甘醇5mL和辛酸0.1mL，最后定容 2 GB/T32016—2015 至1000mL。 4.6.5不同pH和离子强度的洗脱用缓冲液与再生液：配制方法同4.4.4。 4.6.6三酮溶液：配制方法同4.4.5。 4.6.7色氨酸标准储备液：准确称取色谱纯色氨酸102.0mg，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使 之溶解，定量地转移至100mL容量瓶中，加水定容。色氨酸浓度为5.00umol/mL。 4.6.8色氨酸标准工作液：准确吸取2.00mL色氨酸标准储备液（4.6.7）置于50mL容量瓶中，并用稀 释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.6.4)进行定容，使色氨酸浓度为200nmol/mL。 注：4.4.7、4.5.8、4.6.8中标准工作液体宜现配现用，也可置于4℃条件下储存，有效期为3个月。 5仪器与设备 5.1 分析天平：分度值≤0.1mg。 5.2水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20mL～30mL。用去离子水冲洗干净并烘干。 5.3 聚四氟乙烯衬管。 真空泵。 喷灯或熔焊机。 恒温干燥箱或水解炉。 5.7 真空干燥器：温度可调节 5.8 氨基酸自动分析仪：节三酮柱后衍生离子交换色谱仪，要求各氨基酸的分辨率大于90%。 6样品及前处理 6.1取样 依据GB/T6529在标准大气条件下将样品调湿平衡，剪碎、混匀，用分析天平称取具代表性的样品 1g±0.1g备用。 6.2样品前处理 6.2.1酸水解法 6.2.1.1禾 称取20mg的试样（6.1)置水解管中，加10mL酸解剂（4.4.1),置冷冻剂（4.4.2)中冷冻3min~ 5min。然后，抽真空（近0Pa），充人氮气，再抽真空充氮气，重复三次，在充氮气状态下封口。 6.2.1.2将封口后的水解管放在（110士1)℃恒温干燥箱中，水解22h。 6.2.1.3取出水解管，冷却至室温，混、开管、过滤，用水多次冲洗水解管，并与水解液全部转移至 100mL容量瓶中用水定容。吸取1mL～2mL水解定容液，用真空干燥器在60℃蒸发至干，加少许水 溶解残留物，重复蒸干2～3次。准确加人1mL～2mL的稀释上机用缓冲液（4.4.3），摇匀，充分溶解 后离心或用0.22um水系微孔滤头过滤后，取上清液上机测定 6.2.2氧化水解法 6.2.2.1氧化：称取50mg的试样（6.1)，置于水解管中，于冰水浴中冷却30min后加人已经冷却的过 甲酸溶液（4.5.1)2mL，待样品全部润湿，盖好试管盖（不能摇动），连同冰水浴一起置于0℃冰箱中，反 应 16 h。 6.2.2.2水解：向样品氧化液（6.2.2.1）中加人氢溴酸（4.5.2）0.3mL，振摇，放回冰水浴静置30min，用 真空干燥器在60℃下蒸发至干。加入酸解剂（4.5.3)15mL，抽真空（近0Pa），充人氮气，再抽真空充氮 3