ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 31798—2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Plenodomus biglobosus (Shoemaker & H.Brun) Gruyter,Aveskamp & Verkley 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 31798—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、华中农业大学。 本标准主要起草人：赵晖、干振华、曾宪东、易建平、李彬、李国庆、吴品珊、蔡翔。 GB/T31798—2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了油菜黑胫病菌（Plenodomusbiglobosus）的检疫鉴定方法。 本标准适用于油菜种子、植株及其产品中油菜黑胫病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3仪器设备和主要试剂 3.1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成 像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器。 3.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682。 3.2.11%次氯酸钠 3.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，异丙醇，无水乙醇。尿素提取液（7mol/LUrea、50mmol/L Tris-HClpH8.0、62.5mmol/LNaCl、1%SDS），蛋白酶K（20mg/mL），苯酚：三氯甲烷：异戊醇 (25：24:1)溶液.3mol/LNaAc(pH5.2)。 3.2.3PCR试剂:10XPCR缓冲液（含25mmol/LMgSO,）,Tag酶，dNTPs 3.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading缓冲液，EB。 3.2.520%V8培养基：V8蔬菜汁（CampbellSoup公司）200mL,CaCO:0.75g，琼脂粉13.0g，蒸馏 水定容至1000mL，调整pH至5.8，121℃高压灭菌20min。 SZIC 3.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂13.0g，蒸 馏水定容至1000mL，调整pH至5.6，121℃高压灭菌20min。 4病菌的鉴定 4.1症状检查 4.1.1种子症状检查 取样品量1%～5%（若样品少可适量增大比例）的种子，在解镜下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的 种子或有霉变的籽粒或病残体，每份种子样品挑选不少于500粒，用做病原菌的分离。另取1kg种子， 1 GB/T 31798—2015 用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取。 4.1.2植株症状检查 形、稍回陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色 斑，或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点，或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位（参见附录A）。 4.2分离培养 4.2.1种子病原菌的分离培养 将挑选的疑带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理1d,转人一20℃下冷冻处理1d，1%次氯 酸钠消毒5min7min，无菌水洗涤3次后，用滤纸吸干种子，按25粒/皿置于V8培养基或PDA培养 基上，在20℃～25℃，12h黑暗/12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第3天开始观察。 4.2.2植株病原菌的分离培养 用解剖刀取植株病健交界处的组织，剪成约0.4cmX0.4cm小段，用1%的次氯酸钠溶液消毒 5min，无菌水洗涤3次，灭菌滤纸吸干水分后置于V8脂培养基或PDA培养基上，同6.2.1培养观察。 4.3鉴定特征 该病菌在培养基上可良好生长，气生菌丝发达，产孢量大。后期（15d）可见到明显的抱子座和粉红 色的孢子溢出。气生菌丝呈白色或微黄，后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴。分生孢子呈长杆 形或梭形，长度在2.5μm～3.0μm之间，宽度在0.8μm～1,1μm之间。在孢子的两端各有一个透明的 小液滴。PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色。该病菌在PDA上产生黄褐色色素。 4.4PCR检测 4.4.1样品DNA提取 取筛上物、筛下物和种子，或植株可疑病变组织各1g～2g液氮研磨后各取样0.1g～0.2g，采用 商业化试剂盒或尿素法提取DNA（参见附录B）。 4.4.2PCR检测方法 PCR检测方法参见附录C，重复3次。用油菜黑胫病菌（Plen：biglobosus）参照菌株DNA作阳性 对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。 5结果判定 病菌的分离培养形态特征符合4.3中描述，可报告检出油菜黑胫病菌。PCR检测作为筛选和辅助 方法。 6样品保存与结果记录 6.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出油菜黑腔病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复 核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 GB/T31798—2015 6.2 2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为油菜黑胫病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于V8培养基或PDA 培养基斜面上，20℃～25℃培养5d，然后4℃冰箱保存，或将菌丝块转人20%灭菌甘油并混匀， 一80℃长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 6.3结果记录与资料保存 完整的试验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并应有试验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片。 3