ICS65.100.10 CCSG25 中华人民共和国国家标准 GB/T19567.1—2025 代替GB/T19567.1—2004 苏云金杆菌母药 Bacillusthuringiensistechnicalconcentrate 2025-10-05发布 2026-05-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T19567.1—2004《苏云金芽胞杆菌原粉》,与GB/T19567.1—2004相比,除结构 调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了苏云金杆菌母药规格及其控制指标,将分等分级更改为统一规定,且指标上不再区分不 同亚种(见4.2,2004年版的3.2); ———更改了苏云金杆菌母药毒力效价测定用试验虫的说明(见4.2,2004年版的3.2); ———更改了苏云金杆菌母药的pH指标(见4.2,2004年版的3.2); ———删除了苏云金杆菌母药的湿筛试验指标(见2004年版的3.2); ———增加了检验规则(见第6章); ———更改了苏云金杆菌悬浮剂的毒力效价测定方法,规定以棉铃虫作试虫的测定方法为仲裁法(见 附录C,2004年版的附录B)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国农药标准化技术委员会(SAC/TC133)归口。 本文件起草单位:农业农村部农药检定所、武汉科诺生物科技股份有限公司、福建绿安生物农药有 限公司、湖北省生物农药工程研究中心、沈阳沈化院测试技术有限公司。 本文件主要起草人:王文卓、杨斯琪、刘煜恒、姜宜飞、吴进龙、李培泽、刘莹、廖先骏、寇雅岚、杨闻翰、 李青、姚荣英、王开梅。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2004年首次发布为GB/T19567.1—2004; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T19567.1—2025 苏云金杆菌母药 1 范围 本文件规定了苏云金杆菌母药的技术要求、检验规则、验收和质量保证期以及标志、标签、包装、储 运,描述了苏云金杆菌母药的试验方法。 本文件适用于苏云金杆菌鲇泽亚种(B.t.a)和苏云金杆菌库斯塔克亚种(B.t.k)母药产品的质量 控制。 注:苏云金杆菌的其他名称、分类地位和形态学特征等描述见附录A。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T1600—2021 农药水分测定方法 GB/T1601 农药pH值的测定方法 GB/T1604 商品农药验收规则 GB/T1605—2001 商品农药采样方法 GB3796 农药包装通则 GB/T8170—2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 毒素蛋白 toxinprotein 在芽孢形成时期产生的一种具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白。 3.2 毒力效价 toxicitypotency 微生物对靶标有害生物的致死或抑制能力差异的生物学指标。 4 技术要求 4.1 外观 灰白色至棕褐色粉末。 4.2 技术指标 苏云金杆菌母药应符合表1要求。 1GB/T19567.1—2025 表1 苏云金杆菌母药技术指标 项 目 指 标 毒素蛋白质量分数/% ≥7.0 毒力效价a/(IU/mg) ≥50000 pH值 4.0~7.0 水分/% ≤6.0 a可选择棉铃虫、小菜蛾或甜菜夜蛾作为实验虫,并用H.a.代表棉铃虫(Helicoverpaarmigera),P.x.代表小菜 蛾(Plutellaxylostella)、S.e.代表甜菜夜蛾(Spodopteraexigua),试验结果分别表示为毒力效价(H.a.)、毒力 效价(P.x.)和毒力效价(S.e.)。 5 试验方法 警告———使用本文件的人员应有实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有的安全问题。使用 者有责任采取适当的安全和健康措施。 5.1 一般规定 本文件所用试剂和水在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和蒸馏水。 5.2 取样 按GB/T1605—2001中5.3.1进行。用随机数表法确定取样的包装件;最终取样量应不少于 100g。 5.3 鉴别试验 5.3.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE) 本鉴别试验可与毒素蛋白质量分数的测定同时进行。在相同的操作条件下,试样溶液与标样溶液 应具有相同的蛋白区带,由此证明产品中的毒素蛋白的相对分子质量为130000。 5.3.2 生物测定法 采用形态学特征观察和分子生物学鉴定相结合的方式进行。 有效成分的特征见附录A。 5.4 外观 采用目测法测定。 5.5 毒素蛋白质量分数 5.5.1 原理 用碱性溶液处理苏云金杆菌母药伴孢晶体,使其降解为毒素蛋白,然后通过SDS-PAGE,依据蛋白 质相对分子质量的差异,使毒素蛋白与其他杂蛋白分离,之后用电泳凝胶成像系统扫描蛋白区带面积, 进行定量。 2GB/T19567.1—2025 5.5.2 试剂和溶液 5.5.2.1 水。 5.5.2.2 十二烷基硫酸钠。 5.5.2.3 三羟基甲基氨基甲烷。 5.5.2.4 浓盐酸。 5.5.2.5 氢氧化钠。 5.5.2.6 甘氨酸。 5.5.2.7 甘油。 5.5.2.8 巯基乙醇。 5.5.2.9 溴酚蓝。 5.5.2.10 考马斯亮蓝R-250。 5.5.2.11 甲醇。 5.5.2.12 冰乙酸。 5.5.2.13 无水乙醇。 5.5.2.14 0.55mol/L氢氧化钠溶液:在烧杯中量取100mL水,缓慢加入2.2g氢氧化钠,边加入边搅 拌溶解,待充分溶解后,放置室温,密闭保存备用。 5.5.2.15 1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷12.1g溶于水 中,用浓盐酸调至pH6.8,用水定容至100mL。 5.5.2.16 电泳缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷3.0g,甘氨酸14.4g,十二烷基硫酸钠1g,用水溶解并 定容至1000mL。 5.5.2.17 3×样品稀释液:1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液18.8mL,十二烷基硫酸 钠6g,甘油30mL,巯基乙醇15mL,溴酚蓝0.5g,用水定容至100mL。 5.5.2.18 染色液:称取考马斯亮蓝R-2501.0g,加入甲醇450mL,冰乙酸100mL,水450mL,溶解过 滤后使用。 5.5.2.19 脱色液:量取甲醇100mL,冰乙酸35mL,用水定容至1000mL。 5.5.2.20 漂洗液:量取无水乙醇30mL,冰乙酸10mL,水60mL,混合均匀后使用。 5.5.2.21 固定液:量取冰乙酸75mL,用水定容至1000mL。混合均匀后使用。 5.5.2.22 毒素蛋白(相对分子质量为130000)标样且已知质量分数不低于9.0%。 5.5.3 仪器 5.5.3.1 电泳仪。 5.5.3.2 夹芯式垂直电泳槽(1.0mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板(1.0mm,15孔或10孔样品槽模具)。 5.5.3.3 电泳凝胶成像系统。 5.5.3.4 水浴锅。 5.5.3.5 可调移液器。 5.5.3.6 微量进样器。 5.5.3.7 离心机:20000r/min。 5.5.3.8 脱色摇床:90r/min。 5.5.4 测定步骤 5.5.4.1 试样处理 分别称取含5.5mg(精确至0.1mg)毒素蛋白的标样和试样,置于10mL离心管中,加入5mL水, 3GB/T19567.1—2025 充分混匀,移取0.5mL上述溶液至1.5mL离心管中,加入0.55mol/L氢氧化钠溶液0.125mL(使氢 氧化钠溶液的最终浓度为0.1mol/L),摇匀,静置5min,再加入3×样品稀释液0.325mL,于沸水浴中 煮6min,冷却至室温,15000r/min离心5min,取上层清液,以备电泳上样,样品的折算的最终定容体 积为9.5mL。 5.5.4.2 SDS-PAGE分离毒素蛋白 5.5.4.2.1 制备8%~10%聚丙烯酰胺凝胶 采用不连续缓冲系统,制胶方法见附录B。 5.5.4.2.2 上样 取上述标样溶解液上层清液,于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样2μL、4μL、6μL、8μL、 10μL(毒素蛋白质量为1μg~5μg),取6μL的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为3μg)加入到上 样孔中,注入电泳缓冲液后,接通电源。 5.5.4.2.3 电泳 电泳初期电压控制在100V左右,待试样进入分离胶后,加大电压到120V,继续电泳,当指示剂前 沿到达距底端1cm左右时停止电泳,取出胶板,在固定液中浸泡30min。 5.5.4.2.4 染色 将分离胶部分取下,用染色液染色过夜。 5.5.4.2.5 脱色 倒去染色液,先用漂洗液洗涤凝胶,然后加入脱色液,在脱色摇床上使其脱色,根据需要更换几次脱 色液,直至背景清晰为止。 5.5.4.3 测定 凝胶经脱色后,能清晰地看到130000蛋白区带,用电泳凝胶成像系统及相关的图形处理软件处理 该区带,得到各蛋白区带的灰度值。同时,分别以标样溶液作毒素蛋白质量对蛋白区带灰度值的标准曲 线;利用样品溶液的区带灰度值,由标准曲线计算其对应的毒素蛋白质量。 5.5.5 计算 试样中毒素蛋白的