书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３６８０９ — ２０１８ 可可丛枝病菌检疫鉴定方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犕狅狀犻犾犻狅狆犺狋犺狅狉犪狆犲狉狀犻犮犻狅狊犪 ２０１８  ０９  １７ 发布 ２０１９  ０４  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国广东出入境检验检疫局 、 中华人民共和国海南出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 冯黎霞 、 王卫芳 、 何日荣 、 魏霜 、 刘福秀 、 何瑞芳 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８０９ — ２０１８ 可可丛枝病菌检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了植物检疫中可可丛枝病菌 （ 犕狅狀犻犾犻狅狆犺狋犺狅狉犪狆犲狉狀犻犮犻狅狊犪 ） 的检疫鉴定方法 。 本标准适用于可可丛枝病菌的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ１５３８．１ 　 培养基制备指南 　 第 １ 部分 ： 实验室培养基制备质量保证通则 ３ 　 方法原理 可可丛枝病菌在寄主上的为害症状 、 病菌形态学特性与培养特征及分子生物学特征是制定本标准 的主要依据 。 该病菌的分类地位 、 寄主范围 、 分布和为害症状等背景资料参见附录 Ａ 。 ４ 　 设备用具 ４ ． １ 　 仪器设备 体视显微镜 、 生物显微镜 、 电子天平 （ 感量 ０．００１ｇ ）、 高压灭菌器 、 超净工作台 、 生物培养箱 、 ＰＣＲ 仪 、 电泳仪和凝胶成像系统 。 ４ ． ２ 　 实验用具 标签 、 定性滤纸 、 样品袋 、 保鲜袋 、 手持放大镜 、 镊子 、 解剖刀 、 酒精灯 、 接种针 、 培养皿 （ 直径 ９．０ｃｍ ）、 烧杯 、 量筒 、 三角瓶 、 载玻片 、 盖玻片 、 可调移液器 （ 可调范围 ２．５ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）、 离心管 。 ５ 　 试剂和培养基 ５ ． １ 　 试剂 青霉素 、 链霉素 、 无水乙醇 、 马铃薯 、 葡萄糖 、 琼脂 、 ７０％ 乙醇 、 无菌双蒸水 、 ２％ＣＴＡＢ 提取缓冲液 、 １０％ＳＤＳ 溶液 、 ３ｍｏｌ ／ Ｌ 醋酸钠溶液 、 ＰＣＲ 试剂 （ 包括 Ｔａｑ 聚合酶 、 ｄＮＴＰ 、 缓冲液 ）、 苯酚 、 三氯甲烷 、 异戊醇 、 ＴｒｉｓＨＣｌ 、 ＥＤＴＡ （ 乙二胺四乙酸 ）、 琼脂糖 、 分子量标准物 、 ＴＡＥ 电泳缓冲液 。 ５ ． ２ 　 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ）： ２００ｇ 去皮马铃薯 ， ２０ｇ 葡萄糖 ， １８ｇ 琼脂 ， 加水至 １０００ｍＬ ， １２１℃ 高压灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ＰＤＡ 选择性培养基 ： 高压灭菌后的 ＰＤＡ 冷却至 ４５℃ ～ ５０℃ ， 无菌操作条件下 １０００ｍＬ 培养基 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８０９ — ２０１８ 中加入 ０．３ｇ 链霉素和 ０．３ｇ 青霉素 ， 混匀 ， 倒平板 ， 静置备用 。 燕麦可可培养基 ： ２１ｇＣａＳＯ ４ ， ５１７ｇ 干燥的可可枝条 （ 研磨成粉末状 ）， １３８ｇ 燕麦粉 ， ７００ｍＬ 水 ， 混匀后分装到三角瓶中 ， １２１℃ 高压灭菌 ２０ｍｉｎ ， 静置冷却备用 。 配制培养基时 ， 按照 ＳＮ ／ Ｔ１５３８．１ 的要求 。 ６ 　 检验鉴定方法 ６ ． １ 　 症状检查 ６ ． １ ． １ 　 可可种子症状检查 将待检样品倒入洁净白瓷盘内 ， 检查种子是否有粘附 ， 挑选干瘪 、 弱小 、 畸形 、 变色的可疑病种子 ， 用手术刀剥离种皮和种子 ， 检查病部是否有菌丝体 （ 症状特点参见附录 Ｂ 图 Ｂ．１ ）。 无症种子随机取样后待保湿培养 。 ６ ． １ ． ２ 　 苗木症状检查 仔细检查植株枝条有无徒长 、 变色 、 肿胀 ， 树皮有无变色 、 开裂 、 溃疡 、 腐烂 ， 枝条 、 腋芽 、 叶片等部位有无异常增殖 ， 枝条是否从顶端开始干枯死亡 ， 肉眼或显微观察干枯枝条树皮内层是否有菌丝 ， 帚状老枝上是否有真菌担子果 （ 症状特点参见图 Ｂ．１ 、 图 Ｂ．３ 、 图 Ｂ．４ ）， 担子果下方枝条上是否有白色的孢子堆 。 将可疑枝条和种子样品带回实验室作进一步检验 ， 记录样品品种 、 数量 、 来源国及取样地点 、 取样人和取样日期等信息 。 ６ ． ２ 　 实验室鉴定 ６ ． ２ ． １ 　 直接检验 观察记录病组织的外观及剖面症状特点 ， 将有明显病征的病枝与病果置于体视显微镜下检查 ， 挑取病部菌丝体 、 孢子堆 ， 制成玻片 ， 置于生物显微镜下镜检 。 ６ ． ２ ． ２ 　 保湿培养 如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征 ， 则将病枝 （ 剥开树皮 ， 用剪刀剪成 ０．４ｃｍ×０．４ｃｍ ） 或病果 （ 用手术刀剥离种皮和种子 ） 置于样品袋中 ， 于 ２５℃ 在黑暗条件下保湿培养 ， ５ｄ 后 ， 观察症状的变化 ， 进行显微镜检及病原菌的分离培养 。 ６ ． ２ ． ３ 　 菌丝体分离培养 直接挑取病部的子实体或孢子团 ， 置于 ＰＤＡ 选择性培养基平板上 ； 或采用组织分离培养法 ， 用 ７０％ 乙醇对植物组织表面消毒 ３０ｓ ， 风干后用消毒过的刀片切取病健交界处组织 ， 切成 ０．４ｃｍ×０．４ｃｍ 小块后放置于 ＰＤＡ 选择性培养基平板上 ， 在黑暗或弱光条件下 ２８℃ 培养 ５ｄ ～ １５ｄ ， 定期观察 ， 将菌落边缘菌丝体置于新鲜的 ＰＤＡ 平板上进行纯化 ， 以便于后续的形态学和分子生物学鉴定 。 ６ ． ２ ． ４ 　 担子果和担孢子纯化培养 挑取 ＰＤＡ 平板上培养的菌丝块 ， 植入无菌燕麦可可培养基 ， ２８℃ 、 黑暗或弱光条件下保湿培养 ３０ｄ ， 放大镜或肉眼观察是否有担子果产生 ， 担子果下方是否有白色的担孢子堆 。 ６ ． ２ ． ５ 　 病原菌形态和培养性状观察 ＰＤＡ 上纯化菌落生长 ７ｄ 后 ， 体式显微镜下观测菌落中是否有病菌孢子形成 ， 记录菌落培养性状 ， ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８０９ — ２０１８ 包括菌落生长速度 、 颜色 、 形状等 ， 如有孢子产生 ， 则将培养皿放在显微镜 （ １００× ） 或 （ ２００× ） 下观察孢子生长方式 ， 并挑取少许制片 ， 在生物显微镜下镜检 ， 观测菌丝 、 孢子形态特征 。 显微镜 （ １０００× ） 下测量孢子的形状 、 大小 、 孢子孢壁厚度等 。 在 ２８℃ 、 黑暗或弱光条件下 ， 观察菌落生长速度 、 颜色变化 、 担子果和担孢子的形成情况 。 相似致病菌可可链疫孢荚腐病菌的菌丝体和菌落特征与可可丛枝病菌有显著不同 ， 两者的异同点是鉴定区分两病菌的关键 （ 两者异同点参见附录 Ｃ ）。 ６ ． ２ ． ６ 　 分子生物学鉴定 ６ ． ２ ． ６ ． １ 　 犇犖犃 提取 采用附录 Ｄ 的方法提取病菌基因组 ＤＮＡ 。 ６ ． ２ ． ６ ． ２ 　 犘犆犚 检测及 犐犜犛 基因分析 采用附录 Ｄ 扩增检测病菌基因组 ＤＮＡ 中的 ＩＴＳ 基因 ， 测序后进行 ＢＬＡＳＴ 与系统发育分析 。 ７ 　 鉴定特征 ７ ． １ 　 病菌形态 新鲜菌丝无色 ， 呈弯曲膨大状态 ， 菌丝间相互缠绕 ， 菌丝宽 ５ μ ｍ ～ ５０ μ ｍ ， 为单核菌丝 ； 随时间推移 ， 菌丝变细窄 ， 菌丝宽 １ μ ｍ ～ ３ μ ｍ ， 成长为双核菌丝 ， 并开始出现锁状联合 （ 菌丝体形态参见图 Ｂ．２ ）。 在适当的湿度条件下 ， 产生担子果 ， 呈蘑菇状 ， 菌盖粉红至深红 ，（ ３１ μ ｍ ～ ３２ μ ｍ ） × （ ７ μ ｍ ～ ９ μ ｍ ）， 担孢子纯白色 ， 半透明 ，（ ７ μ ｍ ～ １１ μ ｍ ） × （ ４ μ ｍ ～ ５ μ ｍ ）。 ７ ． ２ 　 菌落特征 菌落在 ＰＤＡ 平板上初为纯白色 ， 后为奶油色 ， 圆形 ， 不隆起 ， 菌丝致密 ， 平铺于培养基表面形成毡状菌丝层 ， 打开培养皿盖 ， 菌落有蘑菇气味 。 ７ ． ３ 　 犐犜犛 序列特征 ＰＣＲ 扩增产物大小约为 ６５０ｂｐ ， 在 ＧｅｎＢａｎｋ 中进行 ＢＬＡＳＴ 分析 ， 病菌与已知的可可丛枝病菌菌株的 ＩＴＳ１１８Ｓ 、 ５．８ＳＩＳＴ２ 、 ２８Ｓ 区域序列 ＧＱ９１９１３８ 、 ＧＱ９１９１２０ 、 ＧＱ９１９１１８ 、 ＥＵ０４７９３０ 、 ＥＵ０４７９３６ 等的同源性最高 ， 系统发育分析显示病菌菌株与可可丛枝病菌聚在同一簇 。 ８ 　 结果鉴定 符合下列任一种情况均可判定为检出可可丛枝病菌 ： ——— 如果病部有明显的病状和病征 ， 病菌形态学特征与鉴定指标 ７．１ 吻合 ， 扩增得到的 ＩＴＳ 序列在系统发育树上与可可丛枝病菌聚在一簇 ； ——— 如果病部有病状但无病征 ， 经保湿培养和 ／ 或分离培养所产生的病菌形态学特征及培养性状与鉴定指标 ７．１ ～ ７．２ 吻合 ， 并且扩增得到的 ＩＴＳ 基因在系统发育树上与