ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33119—2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofEutypalata(Pers.)Tul.etC.Tul 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、青岛检验检疫技术发展中心、中华人民 共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检 验检疫局、中国科学院微生物研究所。 本标准主要起草人:王英超、段维军、厉艳、吴兴海、封立平、魏晓棠、甘琴华、纪瑛、邵秀玲、姚剑、 王振华、郭立新、蔡磊。 ⅠGB/T33119—2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了葡萄藤猝倒病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于葡萄等寄主植物中葡萄藤猝倒病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589 植物病原真菌检测规范 3 葡萄藤猝倒病菌基本信息 学名:Eutypalata(Pers.)Tul.etC.Tul. 异名:EutypaarmeniacaeHansf.&M.V.Carter;Eutypafraxini(Nitschke)Sacc;Eutypamil- liaria(Fr.)Sacc.;Eutypalatavar.acerisRappaz,Mycol.Helv;CytosporinalataHohn;Libertella blepharisA.L.Sm. 分类地位:采用《真菌词典》第10版分类系统,葡萄藤猝倒病菌(Eutypalata)属真菌界(Fungi),子 囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes),炭角菌目 (Xylariales),蕉孢壳科(Diatrypaceae),弯孢壳属(EutypaTul.&C.Tul.1863)。 传播途径:植物体在贸易和运输中能够传播该病害。植物体主要指树皮(孢子和菌丝),地上部分的 茎、嫩枝、主干、枝条(菌丝),木材(孢子和菌丝)等。 葡萄藤猝倒病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 葡萄藤猝倒病菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方 法的主要依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 生物显微镜、电子天平(感量0.001g)、离心机(12000g)、普通冰箱、超低温冰箱(-80℃)、涡旋振 荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、可调微量加样 器、全自动DNA提取仪。 1GB/T33119—2016 5.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 0.5%次氯酸钠(NaClO)、葡萄糖、琼脂、硫酸链霉素、盐酸金霉素、氯硝胺。 6 现场检疫 按照SN/T2589,仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录A)。茎 部主要看有无溃疡症状;枝条是否长势短小,发育受阻,着生的叶子是否萎黄,卷缩变形或破碎;顶部是 否出现枯萎症状。对可疑植物、繁殖材料应取样送实验室做进一步检验,取样方法和步骤参照 SN/T2122。 7 实验室检疫 7.1 PCR凝胶电泳初筛检测 将第6章中的可疑植物、繁殖材料等样品进行PCR初筛检测,PCR凝胶电泳检测见附录B。对于 阳性结果进行下一步检测。 7.2 病原菌的分离和培养 7.2.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基和选择性培养基的制备 马铃薯(去皮)200g;葡萄糖20g;琼脂15g;蒸馏水补至1000mL,121℃湿热灭菌20min备用。 分离培养时加硫酸链霉素(100μg/mL)、盐酸金霉素(50μg/mL)、氯硝胺(5μg/mL)作为选择性培 养基。 7.2.2 病原菌检查 检查寄主的树皮、枝条等组织有无子座、子囊壳,在显微镜下观察病菌的子囊壳,记录其形态特征, 测量子囊和子囊孢子的大小。所获得分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行单孢分离纯化。 7.2.3 组织中病原菌的分离和培养 如果发现可疑症状,但不能按7.2.2进行有性型形态检查,应采取下列分离培养的方法做进一步的 鉴定。剥去树皮,纵向劈开树干露出内部溃疡的边缘。在无菌条件下,从溃疡部分的外部边缘切取 1cm2的薄木片,放在0.5%次氯酸钠溶液中浸泡2min~5min,用无菌水重复洗3次,然后用无菌滤纸 吸干,放在选择性培养基上进行培养。24℃培养4d~7d后,将疑似菌落转到马铃薯葡萄糖琼脂培养 基上进行分离纯化。 8 鉴定特征 8.1 PCR凝胶电泳初筛检测 判定结果见附录B。 8.2 培养性状 葡萄藤猝倒病菌在PDA培养基首先形成白色棉絮状菌丝,培养基背面奶油色。2周后,培养基上 2GB/T33119—2016 出现灰色色素,培养基背面变成黑色。3周~4周后,在连续的光照培养下,形成小的黑色的分生孢子 器。分生孢子丝状,直或弯曲,数量多,大小(20μm~45μm)×(0.8μm~1.5μm)。见附录C。 8.3 子囊壳的特征 子囊壳直径大约0.5mm,在枝干或茎上不规则分布。子囊壳的孔口裂出,具有不明显的沟槽。子 囊从子囊壳顶点释放,子囊顶尖内陷,子囊大小(30μm~60μm)×(5μm~7.5μm),子囊柄长60μm~ 130μm,数量很多,纺锤状,内含有8个子囊孢子。子囊孢子香肠状,金棕色,亚透明,(6.5μm~11μm)× (1.8μm~2μm)。在培养基上不能生成子囊壳(见附录C)。 9 结果判定 以PCR初筛结果、分离物的培养性状、子囊壳的特征等作为鉴定依据,进行综合判定。若PCR初 筛结果为阳性,并发现子囊壳,且与8.3鉴定特征吻合,鉴定为葡萄藤猝倒病菌;若PCR初筛结果为阳 性,未发现子囊壳,但与8.2鉴定特征吻合,鉴定为葡萄藤猝倒病菌。 10 样品保存 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出葡萄藤猝倒病菌的样品应保存于4℃冰箱中,以备 复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 10.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为葡萄藤猝倒病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼 脂培养基斜面上,24℃培养72h,然后4℃冰箱保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 10.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 3GB/T33119—2016 附 录 A (资料性附录) 葡萄藤猝倒病菌其他信息 A.1 名称 中文名:葡萄藤猝倒病菌。 英文名:Eutypadiebackdisease。 A.2 寄主范围 全世界范围来说,葡萄藤猝倒病菌能从至少52个属88种木本双子叶植物中分离到。危害的主要 经济作物包括葡萄属、杏属、李属。在美国加利福尼亚州该病害严重影响葡萄、杏和甜樱桃的产量,是该 地区葡萄上的三大病害之一。在法国和意大利,损失最严重的是葡萄。在澳大利亚和土耳其,损失最严 重的是杏树。自然寄主包括银荆(Acaciadealbata)、栓皮槭(Acercampestre)、埃及榕(Acerpseudo- platanus)、草莓树(Arbutusmenziesii)、熊果属(Arctostaphylos)、欧洲鹅耳(Carpinusbetulus)、美洲 茶属(Ceanothus)、日本木瓜(Chaenomelesjaponica)、柑桔属(Citrus)、欧榛(Corylusavellana)、毡毛 栒子(Cotoneasterpannosa)、柳叶栒子(Cotoneastersalicifolius)、山楂属(Crataegus)、榅桲(Cydonia oblonga)、柿(Diospyroskaki)、枇杷(Eriobotryajaponica)、欧洲水青冈(Fagussylvatica)、无花果 (Ficuscarica)、欧洲白蜡树(Fraxinusexcelsior)、染料木属(Genista)、洋常春藤(Hederahelix)、胡桃 (Juglansregia)、毒豆(Laburnumanagyroides)、马缨丹(Lantanacamara)、欧洲女贞(Ligustrum vulgare)、欧洲忍冬(Loniceraxylosteum)、苹果(Maluspumila)、欧洲夹竹桃(Neriumoleander)、木 樨榄(Oleaeuropaeasubsp.europaea)、阿月浑子乳香树(Pistacialentiscus)、阿月浑子(Pistacia vera)、维多利亚海桐(Pittosporumundulatum)、悬铃木(Platanusacerifolia)、黑杨(Populusnigra)、 欧洲山杨(Populustremula)、杏(Prunusarmeniaca)、欧洲甜樱桃(Prunusav