ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33019—2016 桃树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPseudomonassyringaepv.persicae 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院。 本标准主要起草人:冯建军、李秋枫、刘新娇、龙海、陈冬美、赵文军、冯黎霞、章桂明、吴颖。 ⅠGB/T33019—2016 桃树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了桃树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法。 本标准适用于国际贸易和有害生物监测中桃树细菌性溃疡病菌的检测鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 3 桃树细菌性溃疡病菌基本信息 学名:Pseudomonassyringaepv.persicae(PrunierLuisetti&Gardan,1970) 异名:Pseudomonasmorspruorumsubsp.persicae(PrunierLuisetti&Gardan,1970) 分类地位:变形菌门(Proteobacteria),γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),假单胞菌目(Pseudo- monadales),假单胞菌科(Pseudomonadaceae),假单胞菌属(Pseudomonas)。 传播途径:带菌繁殖材料是远距离传播的主要途径,农事操作是扩散再侵染的主要途径。 病原菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 依据桃树细菌性溃疡病为害寄主、症状特征以及该病菌的生理学特性、生理生化特性和致病性特征 等进行检测鉴定。 5 仪器、用具和培养基 5.1 仪器 超净工作台、电子天平(感量1/10000g)、低温冰箱、光照恒温培养箱、自动高压灭菌锅。 5.2 用具 接菌环、培养皿(直径:90mm)、离心管(0.2mL、1.5mL、15mL)、微量可调加样器(2μL、10μL、 20μL、100μL、200μL、1000μL)、枪头(20μL、200μL、1000μL)、注射器及针头,pH计。 5.3 培养基 各类培养基配方及相应试剂参见附录B。 1GB/T33019—2016 6 检疫鉴定 6.1 症状观察 该病害主要为害桃树叶片、芽、树干和果实。幼嫩枝条受侵染后,产生圆形休眠芽,初为橄榄绿色, 后迅速变成褐色,甚至导致整个植株枯死。桃树细菌性溃疡病菌为害症状参见A.6。 6.2 病原菌分离培养 取疑似发病植物组织,切取病健交汇处,用75%乙醇表面消毒3min~5min后,无菌水清洗3次, 放在无菌培养皿上用无菌刀片切成小块后浸置于200μL无菌磷酸缓冲液或无菌水中15min,用稀释 法或无菌接菌环蘸取浸泡液划线接种到金氏B培养基平板上,阳性菌株作为对照划线。24℃恒温培养 3d~4d后,观察菌落生长情况,进行菌种纯化。 6.3 菌落特征 纯化的桃树细菌性溃疡病菌在金氏B固体培养基上培养3d~4d后,可生长不规则单菌落,表面 平展,半透明,灰白色,直径2mm~3mm。 6.4 形态特征 按GB4789.28中规定方法或商业染色试剂盒进行革兰氏和鞭毛染色,显微镜观察菌体形态。 桃树细菌性溃疡病菌为革兰氏阴性菌、短杆状、有3根~6根极生鞭毛。 6.5 生理生化试验 6.5.1 LOPAT试验 利用供试菌进行蔗糖形成果聚糖、氧化酶反应、果胶溶解能力、精氨酸双水解反应和烟草过敏反应, 上述五种反应试验合称LOPAT试验,方法见附录C。 LOPAT试验结果为:+―――+。 6.5.2 其他试验 利用供试菌进行荧光性试验、明胶液化试验、七叶灵水解试验、产酸试验、以及酒石酸盐利用试验, 方法见附录D。 试验结果见表D.1。 6.6 致病性试验 通过接菌油桃、桃或者李感病品种的休眠芽来测试致病性。将供试菌株在金氏B培养基上培养 24h~48h后,用无菌水配制成约107CFU/mL的细菌悬浮液,阳性菌株悬浮液和无菌水分别作为阳 性对照和空白对照。用解剖刀横切形成木质部伤口或者新鲜叶片伤口上滴加细菌悬浮液,然后用塑料 胶带将接种后的伤口或者叶片伤口包扎5d,观察是否出现坏死症状,与对照处理进行比较。每一供试 菌株至少接菌五个处理。 7 结果判定 分离纯化的菌株其菌落特征符合6.3,形态特征符合6.4,生理生化特征符合6.5,致病性试验表现典 2GB/T33019—2016 型症状,则可以判定检出桃树细菌性溃疡病菌。 8 记录和样品菌株保存 8.1 结果记录和资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、采集时间,实验时间、地点、方法和结果等,并要有实验人 员和审核人员签字。 8.2 样品保存 保存样品经记录和经手人签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存6个月。对于检出桃树细菌 性溃疡病菌的样品至少保存1年,以备复检、谈判和仲裁,样品保存期满后,需经高温灭菌后方可处理。 8.3 菌株保存 从检测样品中分离到并鉴定为桃树细菌性溃疡病菌的分离物,应妥善保存。将菌株接种于YDC 培养基试管斜面,24℃恒温培养48h后,直接挑取菌落到灭菌的30%甘油中,制成菌悬液置于-80℃ 超低温下保存;或者用真空冷冻干燥机制成冻干粉,-20℃下长期保存。 3GB/T33019—2016 附 录 A (资料性附录) 桃树细菌性溃疡病菌基本信息 A.1 病害英文名 Bacterialdiebackofpeach。 A.2 病害中文名 桃树细菌性溃疡病。 A.3 地理分布 欧洲:比利时、保加利亚、克罗地亚、法国、塞尔维亚、斯洛伐克、英国。 大洋洲:新西兰。 A.4 寄主范围 桃(AmygdaluspersicaL.)、油桃(Prunuspersicavar.nectarinaM.)、李(PrunussalicinaL.)。 A.5 传播方式 主要通过国际间调运被感染的桃树繁殖材料和果实产品而远距离传播;田间也可以通过雨水、修剪 等农事操作传播;没有症状的果实无重要的风险。 A.6 为害症状 该病害主要为害桃树叶片、芽、树干和果实。受侵染后经过越冬的桃树幼嫩枝条产生圆形休眠芽, 初为橄榄绿色,后迅速变成褐色;侵染很快扩展到整个植株造成枯死。5年~6年生幼树最易感病,受侵 染组织出现红褐色。为害症状如下: a) 叶片上:产生水浸状的小角斑,然后变褐,直径1mm~2mm,周围有褪色绿晕圈(图A.1),坏 死组织最后脱落引起穿孔,发病严重时叶片提早脱落; b) 幼芽/枝上,从感染的节点处扩展为环剥病斑,同时在节间处形成小的椭圆病斑(图A.2); c) 树干上:在修剪切口处或在发病枝梢、分枝的着生处附近,形成具有明显边缘的溃疡(图A.3); d) 果实上:在有些品种上尤其是油桃,产生直径1mm~2mm的黑色圆形油斑,并在果肉组织里 扩展内陷,并溢出胶体(图A.4)。 4GB/T33019—2016 注:引自J.L.Gaignard&J.Luisetti。 注:引自INRA-Angers。 图A.1 叶片症状 图A.2 休眠芽坏死斑 注:引自INRA-Angers。 注:引自INRA-Angers。 图A.3 树干症状 图A.4 幼果症状 5GB/T33019—2016 附 录 B (资料性附录) 常用培养基配方 B.1 金氏B培养基 蛋白胨 20g 琼脂 15g 硫酸镁 15g 磷酸氢二钾 1.5g 甘油 10mL 蒸馏水 1000mL pH=7.0~7.2,121℃灭菌15min。 B.2 YDC培养基(Yeastextract-Dextrose-Calciumcarbonate) 酵母粉 10g 碳酸钙超微粉末 20g 葡萄糖 20g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL 其中葡萄糖单独置于100mL蒸馏水中溶解,121℃高温灭菌15min后置于水浴锅后冷却至 55℃,将葡萄糖加入培养基中并充分摇匀后倒入培养皿或试管备用。 B.3 CSGA培养基(Casamino-sucrose-gelatinmedium) 酸水解酪蛋白 10.0g 酵母粉 5.0g 蔗糖 5.0g 磷酸氢二钾 4.0g 明胶 100g 蒸馏水 1000mL pH=7.0~7.2,121℃灭菌15min。 B.4 营养肉汤(nutritionbroth,NB) 牛肉浸膏 3.0g 蛋白胨 5.0g 蒸馏水 1000mL 若是需要固体培养基(NA),加入15g琼脂粉。 pH=7.0~7.2,121℃灭菌15min。 B.5 蔗糖蛋白胨培养基(SPA) 蔗糖 3g 蛋白胨 5g 磷酸氢二钾 0.5g 硫酸镁 0.25g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL pH=7.2~7.4,121℃灭菌15min。 6GB/T33019—2016