ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T32948—2016 犬科动物感染细粒棘球绦虫粪 抗原的抗体夹心酶联免疫吸附 试验检测技术 Detectionofcoproantigenofcanidaeinfected Echinococcusgranulosus(E.g)bysandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay 2016-08-29发布 2017-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准起草人:张壮志、张文宝、张旭、米晓云、古努尔·吐尔逊、石保新、范伟兴、吐尔洪·依米提、 赵莉、巫剑、王进成。 ⅠGB/T32948—2016 犬科动物感染细粒棘球绦虫粪 抗原的抗体夹心酶联免疫吸附 试验检测技术 1 范围 本标准规定了细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验(SandwichELISA)检测技术 要求。 本标准适用于细粒棘球绦虫感染终末宿主(犬科动物)的诊断、检疫、效果考核及其相关流行病学 调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细粒棘球绦虫粪抗原 fecalantigenofEchinococcusgranulosus 细粒棘球绦虫寄生于犬科动物肠道,随粪便一同排出的虫体分泌物、代谢物和脱落孕节。 3.2 抗体夹心 antibodysandwich 多克隆抗体与抗原免疫结合,抗原再与单克隆抗体发生特异性结合,形成抗体-抗原-抗体“三明治” 式的复合物。 3.3 细粒棘球绦虫成虫体表抗原 thesurfaceantigenofEchinococcusgranulosus 细粒棘球绦虫成虫经1%Triton×100作用后获得的体表抗原(EgsfAg)。 3.4 兔抗EgsfAg的免疫球蛋白 Gtherabbit'simmunoglobulinGagainstEgsfAg 纯化的抗EgsfAg多克隆兔抗体IgG(蛋白含量为11.12mg/mL,抗体滴度为1∶160000以上)。 3.5 抗EgsfAg的鼠单克隆抗体 mousemonoclonalantibodyagainstEgsfAg 抗EgsfAg的鼠单克隆抗体(蛋白含量为14.4mg/mL,抗体滴度为1∶80000以上)。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1GB/T32948—2016 OD值 某一物质在某一个特定波长下的吸光度(opticaldensity) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution) PBST 含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline) TMB 四甲基乙二胺联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) EgsfAg 细粒棘球绦虫成虫体表抗原(thesurfaceantigenofEchinococcusgranulosus) EgsfAgRIgG 兔抗EgsfAg的免疫球蛋白G(therabbit􀆳simmunoglobulinGagainstEgsfAg) EgXJ09McAb 抗EgsfAg的鼠单克隆抗体(mousemonoclonalantibodyagainstEgsfAg) BSA 牛血清白蛋白(albuminfrombovineserum) PB 底物缓冲液(substratebuffer) TritonX-100 聚乙二醇辛基苯基醚,非离子表面活性剂[polyethyleneglycolmono(p-1,1,3,3- tetramethylbutyl)phenylether] DMSO 二甲基亚砜(dimethylsulfoxide) 5 原理 将EgsfAgRIgG固着在载体(PVC)表面,并保持其免疫活性,待检抗原(犬粪便样品中Eg粪抗原) 与前述抗体结合,被吸附的Eg粪抗原再与EgXJ09McAb特异性结合,利用兔抗鼠(IgG)二抗HRP与 前述被捕捉的单克隆抗体特异性结合,携带的酶催化底物显色。底物转化为有色产物的量与酶量及待 检样品中抗原量成正比,故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析待检样品阴、阳性。阴性样品说明 该被检终末宿主没有感染细粒棘球绦虫;阳性样品说明被检宿主感染了细粒棘球绦虫。 6 试剂材料与设备仪器 6.1 试剂与材料 本标准试剂除特殊规定外,均指分析纯试剂。 PBS(见附录A):常温保存。 PBST(见附录A):常温保存。 包被液(pH=9.6):Na2CO30.16g,NaHCO30.29g,H2O100mL,4℃保存。 封闭液:脱脂奶粉5g,PBS100mL,4℃保存。 EgsfAgRIgG:-20℃保存。 EgXJ09McAb:-70℃保存。 兔抗鼠(IgG)二抗HRP:-20℃保存。 TMB底物缓冲液(见附录A):4℃保存。 TMB底物显色剂(见附录A):4℃保存。 TMB底物显色液(见附录A):4℃保存。 终止液:浓H2SO410mL,H2O80mL,常温保存。 1%BSA:BSA1g,PBS100mL,4℃保存。 96孔酶标反应板:-20℃。 6.2 设备仪器及耗材 低温台式高速离心机:要求最大离心力在12000g以上。含有450nm波长的酶标仪。37℃恒温 培养箱。振荡混匀器。电子天平(精确度:0.01g)。2℃~4℃冰箱、-20℃冰柜和-70℃超低温 冰箱。 2GB/T32948—2016 可调移液器一套,12道微量移液器(50μL~300μL),与移液器配套的吸头。50mL塑料离心管、 记号笔、塑料自封带、竹签、一次性手套、口罩、帽子、胶鞋、连体防护服等。 7 样品采集与处理 7.1 样品采集、运输和储存 用无菌竹签收集尽可能新鲜的犬粪便2g~3g,装入50mL离心管内,编号,登记。用塑料自封袋 将其封闭后,置于加冰的保温箱中,冷冻运至实验室;保存-20℃以下,待检。 7.2 样品处理 将犬粪样置-70℃,低温冷冻至少1周,以灭活病原。室温解冻,粪样加等量PBST(按质量比),充 分溶解混匀,静置30min,4000g,离心15min,上清液即可用于检测。该上清液可在2℃~8℃条件 下保存1周;若需长期保存,应分装放在-20℃以下冰柜内,避免反复冻融。 7.3 避免污染 采样和处理过程中样本不得交叉污染,采样及样品处理过程中应注意安全防护,应戴一次性手套、 口罩、帽子,穿胶鞋(或鞋套)和连体防护服等。 8 操作方法 8.1 抗体包被 将适宜浓度的EgsfAgRIgG(5μg/mL)包被96孔酶标反应板,100μL/孔,反应板盖严,并在4℃ 下孵育过夜。 8.2 封闭反应板 用PBST洗涤3次,每次加入洗液后放置1min;倒出后拍打干净。加入封闭液,200μL/孔,反应板 37℃湿盒孵育1h。 8.3 加样 用PBST洗涤3次,每次加入洗液后放置1min;倒出后拍打干净。A1、A2孔加入样品稀释液, 100μL/孔;B1、B2至E1、E2孔加入标准阴性抗原N1~N4(见附录A),100μL/孔;F1、F2孔加入标准 阳性抗原P(见附录A),100μL/孔;其余孔先加入PBST80μL/孔,然后加入检测样本上清,20μL/孔, 混匀,每个检测样品加2孔(建议加样参照附录C示意图),37℃湿盒密闭孵育30min。按加样顺序应 详细记录检测样本信息(包括编号、日期等)。 8.4 结合单克隆抗体 用PBST洗涤3次,每次加入洗液后放置1min;倒出后拍打干净。除空白孔外,加入 EgXJ09McAb(建议工作滴度为1∶4000~1∶6000),100μL/孔,37℃湿盒密闭孵育30min。 8.5 结合酶标二抗 用PBST洗涤3次,每次加入洗液后放置1min;倒出后拍打干净。除空白孔外,加兔抗鼠(IgG)二 抗HRP,100μL/孔,37℃湿盒密闭孵育30min。 3GB/T32948—2016 8.6 底物显色 用PBST洗涤3次,每次加入洗液后放置1min;倒出后拍打干净。加入TMB底物显色液100μL/ 孔,37℃避光孵育15min。 8.7 终止反应和读值 加入终止液50μL/孔,10min内读取450nm的OD值,并计算空白孔、阳性孔、阴性孔和检测样品 孔的平均OD值。 9 结果判定 9.1 有效原则 当ELISA反应结束并加入终止液后10min内用酶标仪测量各孔在450nm波长时的光吸收值 (OD值)。并计算空白孔、标准阳性孔和每个标准阴性孔的OD平均值(N1、N2、N3、N4)。要求空白 孔的OD平均值<标准阴性孔的OD平均值<标准阳性孔的OD平均值;标准阳性OD平均值(P)与所 有标准阴性OD平均值(N)之比大于或等于2.1(即P/N≥2.1),否则检查ELISA板是否合格,加样位 置是否有错误等。 9.2 阴性、阳性判定 计算待测样品OD平均值和标准阴性OD值平均之比。当待测样品OD平均值(P)与所有标准阴 性OD平均值(N)之比大于或等于2.1(即P/N≥2.1