ICS71.040.30 G66 中华人民共和国国家标准 GB/T32226—2015 果糖二磷酸钠(FDP)含量测定用 固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂 Specificsolidenzyme(ALD,TIM,GDH)reagentfor determinationoffructosediphosphate(FDP) 2015-12-10发布 2016-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:中国测试技术研究院、北京众宜隆润科技有限公司。 本标准起草人:谭和平、赵军、周李华、张莉莉、孙登峰、王晓平、叶德萍。 ⅠGB/T32226—2015 果糖二磷酸钠(FDP)含量测定用 固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂 1 范围 本标准规定了果糖二磷酸钠(FDP)含量测定用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂的技术要求、试 验方法、检验规则、标志、包装和贮存。 本标准适用于果糖二磷酸钠(FDP)含量测定用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T9721 化学试剂 分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分) GB15346 化学试剂 包装及标志 GB19489 实验室 生物安全通用要求 HG/T3921 化学试剂 采样及验收规则 JJF1070 定量包装商品净含量计量检验规则 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 固体复合酶 solidenzyme 果糖二磷酸钠含量测定用的复合酶试剂,含醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)和甘油磷酸脱 氢酶(GDH)的复合酶试剂。 3.1.2 固体复合酶活力 solidenzymeactivity 室温下,1mg酶在1min内催化果糖二磷酸钠(FDP)的质量(μg),用μg/(min·mg)表示。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ALD:醛缩酶 ALD、TIM、GDH:固体复合酶 DAN:氧化型辅酶Ⅰ FDP:果糖二磷酸钠 GDH:甘油磷酸脱氢酶 NADH:还原辅酶Ⅰ 1GB/T32226—2015 TIM:磷酸丙糖异构酶 4 技术要求 4.1 组成 本固体复合酶由醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)、甘油磷酸脱氢酶(GDH)组成。各组分的 重量份是:ALD(醛缩酶)20%~25%,TIM(磷酸丙糖异构酶)30%~40%,GDH(甘油磷酸脱氢酶) 30%~35%。 4.2 感官要求 本品为浅红色或类白色冻干粉,溶于三羟甲基氨基甲烷溶液(0.1mol/L,pH7.6)。 4.3 理化要求 固体酶活力不小于40μg/(min·mg)。 4.4 卫生要求 符合GB19489的要求。 5 试验方法 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的三级(含三级)以上 的水。 5.1 外观 肉眼观察为浅红色或类白色冻干粉。 5.2 固体复合酶活力的测定 5.2.1 原理 本产品是以动物肌肉为主要原料生产的含ALD、TIM和GDH的复合酶试剂。FDP在NADH的 存在下,先后经ALD、TIM和GDH的作用,一分子FDP能使两分子NADH氧化成DAN,引起 NADH反应前后在340nm处吸光度发生变化,在线性范围内,通过测定NADH在单位时间内产生的 吸光度变化值,可计算固体复合酶的活力。 5.2.2 试剂和溶液 5.2.2.1 盐酸三乙醇胺缓冲液(0.4mol/LpH7.6):取盐酸三乙醇胺18.6g,加水200mL溶解,加 3.7g乙二胺四乙酸二钠,溶解后,用2mol/L氢氧化钠(约18mL)调节pH至7.60,加水稀释至 250mL。或取17.5g三乙醇胺,加水约200mL,加盐酸4mL,混匀,加3.7g乙二胺四乙酸二钠,溶解 后,用2mol/L氢氧化钠溶液或2mol/L盐酸溶液调节pH至7.6,加水稀释至250mL。过滤后4℃保 存,一周内使用。 5.2.2.2 复合酶溶液:取固体复合酶0.1g加盐酸三乙醇胺缓冲液(pH7.6)溶解并稀释至10mL。重熔 漏斗过滤,4℃下保存。 5.2.2.3 还原型辅酶Ⅰ溶液:取还原型辅酶Ⅰ6.5mg,加盐酸三乙醇胺缓冲液溶解,并稀释至50mL。 2GB/T32226—2015 5.2.2.4 果糖二磷酸钠溶液:取果糖二磷酸钠0.3g(按无水物计算),用水溶解并稀释至10mL。 5.2.3 仪器和设备 紫外-可见分光光度法应符合GB/T9721的规定。 5.2.4 分析步骤 取两只石英吸收皿,一只加2.99mL还原型辅酶Ⅰ溶液和10μL果糖二磷酸钠溶液,作为样品池; 另一只加2.99mL盐酸三乙醇胺缓冲液和10μL果糖二磷酸钠溶液,作为空白池,摇匀,静置5min,在 340nm波长处测定吸光度。向样品池中加入40μL复合酶溶液,在20℃~25℃立即摇匀并准确记 时,于1min,2min,3min,4min,5min分别测定吸光度,以时间为横坐标,吸光度为纵坐标作图,取近 似直线部分的斜率(即平均每分钟吸收度的差值ΔA)。重复测定2次,取平均值。 固体复合酶的活力按式(1)计算: X=ΔA 6.29×103×3×406.06 2×1000 W……………………(1) 式中: X ———固体复合酶的活力,单位为微克每毫克(μg/mg); ΔA ———平均每min吸收度的差值; 3 ———反应溶液体积,单位为毫升(mL); 406.06———果糖二磷酸钠三钠盐的相对分子质量(C6H11Na3O12P2); 1000———毫克转化为微克,单位为微克(μg); 6.29×103———还原型辅酶Ⅰ(DPNH)的摩尔吸收系数; 2 ———果糖二磷酸钠反应系数; W ———加入样品池中的酶溶液质量,单位为毫克(mg)。 5.3 净含量 按JJF1070执行。 6 检验规则 6.1 组批抽样 按HG/T3921的规定进行采样。 6.2 出厂检验 6.2.1 出厂检验项目包括外观、酶活力。 6.2.2 产品出厂前,应由生产厂的质检部门负责按本标准规定逐批进行检验。符合标准要求,并签署 质量合格证的产品方可出厂。 6.3 型式检验 6.3.1 在出厂检验合格的成批产品中随机抽取n+1(n表示产品数量),进行型式检验。 6.3.2 型式检验项目为全项检验,包括外观、酶活力。但有下列情况之一时,也应进行型式检验: a) 产品正常生产时,一季度进行一次; b) 生产工艺、设备、原料有较大改变,可能影响产品质量时; 3GB/T32226—2015 c) 停产半年以上,重新恢复生产时; d) 出厂检验结果与上次型式检验结果有较大差异时; e) 国家监督机构提出型式检验要求时。 6.4 判定规则 抽取样品经检验,所检项目全部合格,则判该批产品为合格品;如果在检验中结果有一项指标不符 合标准时,允许在同批产品中两倍量重新抽样,如复检结果仍有一项不合格者则判该批产品为不合 格品。 7 标志、包装、运输和贮存 7.1 标志 本产品的包装、标志按GB15346的规定执行。 7.2 包装 内包装采用棕色或白色密封玻璃瓶。净含量为0.1g;0.2g;0.3g;0.5g;1g。外包装采用密封塑料 盒。复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂包装瓶上应贴标签,并注明:型号、批号、生产日期、净含量、保质期、 厂名厂址、电话、邮编及使用方法。 7.3 运输 运输时不得与有害物质混放、混运,不得重压,低温避光,控制温度在4℃以下。 7.4 贮存 贮存于-20℃。本产品自生产之日起,保质期为18个月。 4GB/T32226—2015 附 录 A (资料性附录) 固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂含量测定使用说明 A.1 试剂 A.1.1 空白酶溶液 取固体复合酶(活力应符合规定)60mg,用盐酸三乙醇胺缓冲液溶解并稀释至20mL,垂熔漏斗过 滤,4℃保存,两天内使用。 A.1.2 测定酶溶液 取10mL空白酶溶液,加3.0mg还原型辅酶Ⅰ(NADH),溶解后4℃保存,两天内使用。 A.2 供试品溶液的制备 取复合酶适量,精确称定,加水溶解。制成每毫升(mL)约含0.4mg(按无水物计算)的溶液。 A.3 测定方法 糈密量取盐酸三乙醇胺缓冲液2mL,测定酶溶液1mL,置石英吸收池中;另精密量取上述缓冲液 2mL,空白酶溶液1mL,置另一吸收池,作为空白,摇匀,静置15min,在340nm波长处测定吸光度 A1。各池再分别加入供试品溶液0.1mL,摇匀,于20℃~25℃放置10min,在340nm波长处测定, 直至吸光度基本不变,读取吸光度A2。求出吸光度差值(ΔA)(ΔA=A1-1.0333A2)。果糖二磷酸钠 含量按式(A.1)计算: X=ΔA 6.29×103×2×3.0×406.06×n 0.1×W×100%……………………(A.1) 式中: X ———果糖二磷酸钠含量,%; ΔA ———吸光度差值; 3.0 ———加入供试品溶液前样品池中溶液的体积,单位为毫升(mL); 406.06———果糖二磷酸三钠盐的相对分子质