ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31808—2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofAlbugotragopogonis(Pers.)S.F.Gray 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、新疆生产建设兵团农业技术推广总站。 本标准主要起草人:张祥林、王翀、赵冰梅、王文正、张江国、乾义柯。 ⅠGB/T31808—2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了向日葵白锈病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于向日葵种子和植株中向日葵白锈病菌的检疫和鉴定。 2 仪器和用具 生物显微镜、体视显微镜、超净工作台、高压灭菌器、高速离心机、制冰机、全温水浴、PCR扩增仪、 电泳仪、凝胶成像仪、往复式振荡器、培养皿、烧杯、酒精灯、三角瓶、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、量筒、 吸管。 3 试剂 乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、藏红花、次氯酸钠(NaClO),十二烷基硫酸钠(SDS),三羟甲基氨基甲烷-盐 酸(Tris-HCl),氯化镁(MgCl2),乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA),氢氧化钠(NaOH),醋酸钠(NaOAc), 氯化钾(KCl),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),无水乙醇(Ethanol),苯酚(Phenol),三氯甲烷(Chloro- form),异丙醇(Isopropanol),异戊醇(Isoamylalcohol),核酸染料(SYBRGreenⅠ),蛋白酶K,Taq DNA聚合酶(TaqDNApolymerase),脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),DNA分子量标记(DNA Marker),TAE电泳缓冲液(TAEbuffer)。 4 检疫鉴定方法 4.1 田间症状检查 在向日葵现蕾中期至盛花期,到向日葵隔离种植区或大田进行调查,观察向日葵植株发病情况。 4.2 种子带菌检查 选取5g瘪小的向日葵种子,置于干净三角瓶中,加入200mL清水和少量洗衣粉,在往复式振荡器 上振荡10min,倒去洗涤液,再加入等量的清水,重复洗涤3次~5次,直至洗净向日葵种子上的种衣剂 (如无种子包衣,可省略此步),晾干,剥开向日葵种子,将果皮和种仁一起放入装有乳酚油的烧杯中,酒 精灯下煮沸3min,冷却后在解剖镜下用镊子剥取内果皮和种皮,放入一干净培养皿中,加入少量棉蓝- 藏红花染色液,静置5h左右,用95%乙醇清洗后,用镊子夹取内果皮或种皮置于载玻片上,加一滴乳酚 油作浮载剂,盖片镜检。 4.3 病原菌形态观察 用干净刀片刮取少量向日葵病叶背面(或叶柄、花盘等)的白色疱斑中的病菌,置于载玻片上,在生 物显微镜下观察该病菌形态特征,记录孢囊梗、孢子囊、卵孢子的形状及大小。 将制备的向日葵内果皮或种皮玻片,置于生物显微镜下观察病菌形态特征,记录孢囊梗、孢子囊、卵 孢子的形状及大小。 1GB/T31808—2015 4.4 分子生物学检测 4.4.1 DNA提取 取向日葵种子或具疑似症状的向日葵病组织,用CTAB法或试剂盒法提取核酸(见附录B)。 4.4.2 巢式PCR检测 向日葵白锈病菌的巢式PCR检测方法见B.2。 4.4.3 实时荧光PCR检测 向日葵白锈病菌的实时荧光PCR检测方法见B.3。 5 鉴定特征 5.1 为害症状 向日葵受白锈病菌侵染为害后,在叶片正面产生淡黄色或淡绿色病斑,直径1mm~2mm,叶片背 面相对应的部位形成突起的白色疱斑。疱斑表皮破裂后散出白色粉状物(病原菌孢子囊)。疱斑可相互 汇合,形成大的斑块。田间发病严重时,向日葵叶柄和花盘上也会发病。 5.2 病原形态 向日葵白锈病菌菌丝无色,分支,产生短的孢囊梗,(31.48μm~59.19μm)×(6.07μm~16.12μm)。 孢子囊成串产生。孢子囊球形、卵形或多角形,单胞,无色,(16.32μm~21.18μm)×(15.12μm~ 20.54μm)。卵孢子褐色至黑色,壁有刺突,生长在寄主组织(向日葵种子、叶片、叶柄、花盘等)中,大小 (46.57μm~66.82μm)×(45.49μm~65.77μm)。孢子囊在水滴中30min就可萌发,产生游动孢子, 游动孢子直径6μm~12μm,具1条鞭毛。经染色后,带菌向日葵种子的果皮和种皮中可观察到蓝色菌 丝体、孢子囊和孢囊梗,以及褐色卵孢子。 向日葵白锈病菌的形态图参见附录C。 5.3 巢式PCR检测结果 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,通用引物NL1/NL4首轮PCR扩增片段 大小为700bp,特异性引物ATHP3/ATHP4第二轮PCR扩增片段大小为370bp。 5.4 实时荧光PCR检测结果 当空白对照的Ct值≥40,供试菌株的Ct值≤36,则检测结果为阳性,否则为阴性。 6 结果判定 田间向日葵为害症状同5.1,向日葵病组织(向日葵病叶和种子)中病原菌的形态特征与5.2的描述 一致,可判定为向日葵白锈病菌。 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,巢式PCR扩增获得片段大小为370bp的 条带,可判定为向日葵白锈病菌。 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,用实时荧光PCR法检测结果为: ———Ct值小于或等于36,则判定为向日葵白锈病菌; 2GB/T31808—2015 ———Ct值大于或等于40,则判定为非向日葵白锈病菌; ———Ct值在36~40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后,如Ct值小于或等于36或者Ct值大 于或等于40,判定同上;如果检测Ct值仍在36~40之间,则应进行形态学方法鉴定。 7 样品与原始数据保存 7.1 样品保存 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式妥善保存。如样品中发现向日葵白锈病菌,该样品 应保存半年以上,以备复验,如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕,保存期满后应经灭菌处理。 7.2 原始数据保存 样品检测结束后,其原始记录单和检验报告或证书应归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁。 7.3 菌种保存 用干净剪刀将具典型症状的向日葵白锈病叶剪成1cm×1cm左右的小片,置于菌种保藏管中,经 脱水干燥后封好管盖,置于4℃黑暗条件下保存至少12个月,以备复验、谈判和仲裁。 3GB/T31808—2015 附 录 A (资料性附录) 向日葵白锈病菌相关信息 A.1 背景资料 A.1.1 病菌基本信息 中文名:向日葵白锈病菌 英文名:sunflowerwhiterust 学名:Albugotragopogonis(Pers.)S.F.Gray 异名:Albugotragopogi(Pers.)Schroct,Cystopustragopogonis(Pers.)J.Schrit 分类地位:藻菌界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目 (Peronsporsles)、白锈菌科(Albuginaceae)、白锈菌属(Albugo)。 A.1.2 方法原理 根据向日葵白锈病菌形态学特征、为害症状和目标片段的序列特征作为鉴定依据。 A.2 地理分布 世界分布:法国、德国、匈牙利、罗马尼亚、前苏联、津巴布韦、肯尼亚、南非、美国、阿根廷、乌拉圭、玻 利维亚、澳大利亚、印度。 中国分布:新疆伊犁。 A.3 寄主范围 向日葵(HelianthusannuusL.)。 A.4 传播途径 向日葵白锈病菌主要随种子及种子间夹杂的病残体进行远距离传播扩散,田间通过气流、雨水和灌 溉水作近距离传播。 4GB/T31808—2015 附 录 B (规范性附录) 向日葵白锈病菌PCR检测方法 B.1 DNA提取方法 将向日葵种子或病变组织冷冻加液氮研磨,放入1.5mL离心管中,在离心管加入300μL~500μL CTAB缓冲液(含0.1g蛋白酶K)混匀,65℃水浴1h;13000g离心5min,保留上清液;加500μL Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)混匀,13000g离心5min,保留上清液;再加 500μL三氯甲烷∶异戊醇(体积比为24∶1)混匀,13000g离心5min,保留上清液;加入1mL异丙醇 混匀,-70℃下放置1h,或-20℃过夜;13000g离心30min,可见DNA沉淀;70%乙醇洗DNA沉 淀,室温干燥;用30μLTris-EDTA缓冲液溶解病原菌DNA,待用。 也可采用市售试剂盒法提取样品DNA。 B.2 巢式PCR检测 用真菌通用引物NL1/NL4对供试材料进行首轮PCR扩增,通用引物序列如下: NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3' 25μLPCR反应体系:10×缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl21.8μL,2.5mmol/LdNTP2μL, 5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,DNA模板1μL,ddH2O15.5μL。 反应条件:预变性94℃3min;94℃1min,52℃1min,72℃1min,共35个循环;72℃延伸 10min。 将首轮PCR扩增产物稀释500倍后做模板,再用特异性引物ATHP3和ATHP4进行第二轮PCR 扩增。引物序列为: ATHP3:5'-CTTGCAGTCTCTGC