ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31804—2015 苹果锈果类病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofApplescarskinviroid 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共 和国厦门出入境检验检疫局、中国农业科学院植物保护研究所、中华人民共和国北京出入境检验检疫 局、青岛市农业科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:张永江、廖力、廖富荣、辛言言、邓丛良、李世访、马荣群、李明福、李桂芬、魏梅生、 张成标、吴兴海。 ⅠGB/T31804—2015 苹果锈果类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的苹果锈果类病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有苹果锈果类病毒的植物材料的检测鉴定。 2 仪器设备、用具及试剂 2.1 仪器设备 电子分析天平(0.001g)、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪、实时荧光PCR 仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、 涡旋振荡器、微波炉等。 2.2 用具 可调移液器(2.5μL,10μL,20μL,100μL,1000μL)、吸头、离心管(0.2mL,0.5mL,1.5mL)及研 钵等。 2.3 试剂 除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。 R-PAGE试剂见附录B;RT-PCR试剂见附录C;实时荧光RT-PCR试剂见附录D。 3 检测方法 3.1 R-PAGE测定 R-PAGE测定见附录B。 3.2 RT-PCR检测 RT-PCR检测见附录C。 3.3 实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测见附录D。 4 结果判定 样品经第3章中任意两种不同原理的方法检测为阳性,即可判定样品带有ASSVd。 1GB/T31804—2015 5 样品保存与结果记录 5.1 样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并作好登记和标记,以备复核用。保存期满后,需经灭活处理。 5.2 结果记录 完整的试验记录要包括:样品的来源、种类、时间,试验检测时间,地点、方法和结果,并有试验人员 的签字;R-PAGE测定应有银染色结果图片,RT-PCR检测应有电泳结果图片,实时荧光RT-PCR检测 应有扩增曲线结果图片。 2GB/T31804—2015 附 录 A (资料性附录) 苹果锈果类病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 苹果锈果类病毒基本信息 中文名称:苹果锈果类病毒。 学名:Applescarskinviroid。 缩写:ASSVd。 异名:苹果斑纹类病毒(Dappleappleviroid)、梨锈皮类病毒(Pearrustyskinviroid)、Japanesepear fruitdimpleviroid、Apple sabi-ka virus和Manshuringosabi-kabyo。 分类地位:马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)。 传播途径:可通过嫁接、病健根系自然接触及带毒繁殖材料传播。 A.1.2 方法原理 根据ASSVd在寄主植物上的症状进行初步判定;根据RNA自然状态和变性后的不同结构分子在 聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(return-polyacrylamidegel electrophoresis,R-PAGE)检测;根据其核酸序列的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过 电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。 A.2 寄主范围 仅限于蔷薇科(Rosaceae)的苹果属(Malus)和梨属(Pyrus)植物。 很多苹果栽培品种能用作该类病毒的繁殖寄主。 A.3 地理分布 世界:美国、印度、日本、加拿大、英国、意大利、阿根廷及波兰等国家和地区。 中国:江苏、安徽、山东、辽宁、新疆和陕西等苹果主产区。 A.4 基因组特征 ASSVd为一共价闭合环状的单链RNA分子,长约330bp,分子质量为1.1×105u。 A.5 症状 A.5.1 锈果型症状:先从幼果果顶部出现淡绿色水渍状斑块,而后向果梗扩展成木栓化锈斑与纵纹(见 图A.1)。 A.5.2 花脸型症状:病果在着色前无明显变化,着色后果面表现红绿相间的花脸状(见图A.2)。 3GB/T31804—2015 A.5.3 锈果-花脸复合型症状:呈现既有锈斑又有花脸的复合型症状(见图A.3)。 图A.1 图A.2 图A.3 注:图A.2和图A.3引自http://www-intranet.angers.inra.fr/dossiers/virus/。 4GB/T31804—2015 附 录 B (规范性附录) 往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(R-PAGE) B.1 试剂与材料 B.1.1 研磨缓冲液 异硫氰酸胍(GITC)4mol/L;0.5%十二烷基肌氨酸钠(C15H28NNaO3);0.1%曲通-100(Triton- 100);氯化钠(NaCl)10mmol/L;25mmol/L柠檬酸钠(C6H5Na3O7)缓冲液(pH7.0);2%聚乙烯基吡 咯烷酮(PVP);共沉淀剂(CarrierRNA)15μg/mL。 B.1.2 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(Na2EDTA·2H2O,pH8.0) 称取乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)186.1g,溶于700mL水中,用氢氧化钠(NaOH)调 pH至8.0,加水定容至1000mL。 B.1.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水 在100mL水中,加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL,室温过夜,121℃高压灭菌20min。 B.1.4 5×三羟基甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)电泳缓冲液 称取三羟基甲基氨基甲烷(Tris)27g,硼酸(H3BO3)13.75g,量取0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶 液(Na2EDTA·2H2O,pH8.0)10mL,加灭菌双蒸水400mL溶解,定容至500mL。 B.1.5 30%胶贮液 称取丙烯酰胺(C3H5NO)29g,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(C7H10N2O2)1g,加水定容至100mL,过 滤除菌,4℃储存。 B.1.6 10%过硫酸胺溶液(现用现配) 称取0.1g过硫酸铵[(NH4)2S2O8],加水定容至1mL。 B.1.7 四甲基乙二胺(TEMED)。 B.1.8 固定液 量取无水乙醇(C2H5OH)30mL及冰乙酸(C2H4O2)3mL,加水定容至300mL。 B.1.9 染色液 称取硝酸银(AgNO3)0.6g,加水溶解,定容至300mL。 B.1.10 显色液(现配现用) 在300mL水中,加入氢氧化钠(NaOH)3g及甲醛(HCHO)1mL,混合均匀。 B.1.11 终止液 称取碳酸钠(Na2CO3)3.7g,加水溶解,定容至300mL。 注:电泳中用到的丙烯酰胺(C3H5NO)是神经毒剂,避免接触皮肤,操作时要带手套。 B.1.12 纳米磁珠。 B.2 试验步骤 B.2.1 样品RNA的提取 取0.1g样品,加入2.5mL的研磨缓冲液,充分研磨后移入5mL的离心管,4℃,5000r/min,离 5GB/T31804—2015 心5min,留上清液备用。取2mg纳米磁珠于1.5mL的离心管中,离心管置于磁性分离架上,吸附纳 米磁珠,弃上清液。向含有纳米磁珠的离心管中加入800μL备用上清液,用枪反复吹打至没有明显结 块。再向离心管中加入400μL无水乙醇,颠倒混匀,室温放置5min~10min,放置期间颠倒混匀几次。 将离心管瞬离后,置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,弃上清液。向离心管中加入150μL70%的乙醇, 用枪吹打混匀,将离心管置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,弃上清液,并重复2次~5次,至上清液没 有明显颜色。将离心管瞬离后,置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,完全弃除上清液。向离心管中加入 约50μL无RNase的水,用枪反复吹打重新悬浮纳米磁珠,室温放置2min~5min。将离心管置于磁 性分离架上,吸附纳米磁珠,将含有RNA的上清液转移至一无RNA酶污染的离心管中,-80℃冰箱 保存备用。 注:或者选择市售商品化RNA提取试剂盒完成RNA的提取。 B.2.2 电泳 B.2.2.1 凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶浓度为5%。在小烧杯中按顺序加入双蒸水18.77mL,30%凝胶储备液5mL,5× TBE缓冲液6mL,TEMED20μL,10%过硫酸铵(现配现用)210μL,充分混匀后灌胶。然后插入样品 梳。待胶完全凝聚后在电泳槽内加入1×TBE电级缓冲液,然后轻轻拔掉梳子。 B.2.2.2 第一向电泳 常温下进行,电泳缓冲液为1×TBE,电泳方向从负极到正极,恒压200V。上样量为6μL~ 10μL。当二甲苯腈示踪染料迁移到离凝胶底部3cm~4cm处停止电泳。 B.2.2.3 第二向电泳 将正向电泳缓冲液倒出,然后把电泳槽放到70℃~80℃的烘箱中预加热,样品变性30min。同时 将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到80℃。倒入