ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31802—2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTomatospottedwiltvirus 2015-07-03发布 2015-11-20实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:李桂芬、鲁洁、马洁、孔君、王秀芬、杜智欣、张永江、魏梅生。 ⅠGB/T31802—2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了植物检疫中番茄斑萎病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 仪器设备及试剂 3.1 仪器设备 酶标仪、天平(感量1/10000g)、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。 微量移液器(2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌 土等。 3.2 试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C,实时荧光RT-PCR检测试剂见 附录D,生物学测定试剂参见附录E。 4 抽样与样品制备 4.1 抽样 抽样按照SN/T2122的规定进行。 4.2 种子样品制备 将种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中,于25℃生长并进行症状观察。待长出3片~ 4片叶后,将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为一组)并编号。采集叶片用于酶联免疫 测定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定。 4.3 苗木样品制备 将苗木种植于隔离温室中,于25℃生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分 组检测,分组方法和检测方法同4.2。 1GB/T31802—2015 5 检疫鉴定方法 5.1 酶联免疫吸附测定 见附录B。 5.2 RT-PCR检测 见附录C。 5.3 实时荧光RT-PCR检测 见附录D。 5.4 生物学测定 参见附录E。 6 结果判定 样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性,判断待 检样品不携带番茄斑萎病毒。 样品经酶联免疫吸附测定为阳性,RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性,即可判断待检 样品携带番茄斑萎病毒。必要时可进行生物学测定。 7 样品保存与结果记录 7.1 样品保存 经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存,种子可在4℃保存1年,病株可在 -20℃或-80℃冰箱中保存1年,做好标记和登记工作。 7.2 结果记录 完整的记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并应有经手人和实验 人员的签字。酶联测定应有酶联板反应的原始数据,RT-PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光 RT-PCR应有反应原始数据,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。 2GB/T31802—2015 附 录 A (资料性附录) 番茄斑萎病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 基本信息 番茄斑萎病毒学名:Tomatospottedwiltvirus,缩写:TSWV。 分类地位:布尼亚病毒科(Bunyaviridae),番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。 A.1.2 方法原理 根据番茄斑萎病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测;根据该病毒核酸的序 列进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸的序列设计特异性引物和 荧光探针,通过检测的荧光信号进行结果判定。条件允许的情况下,根据番茄斑萎病毒侵染寄主的症状 特点,进行生物学检测。 A.2 寄主范围 番茄斑萎病毒寄主范围非常广泛,包括温带、亚热带和热带的80多个科近千种双子叶和单子叶植 物,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,如花生、莴苣、番木瓜、豌豆、烟草、甜椒、番茄、 秋海棠、菊花、大丽花等。 A.3 病害症状 番茄斑萎病毒侵染不同的寄主及农作物后所产生的症状各不相同,常见症状为叶片上产生黄色或 褐色的环斑或线纹斑,有的叶片上形成坏死斑,在叶柄和茎秆上产生黑色条纹。发病植株通常矮化或顶 枯,有的萎蔫而最终死亡。 A.4 分布 番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒,分布于欧洲和地中海地区、亚洲、 非洲、北美洲、中美洲和加勒比海、南美洲和大洋洲。 A.5 传播方式 番茄斑萎病毒容易通过介体———蓟马以持久性方式进行自然传播,机械接种和嫁接也可传播,还可 以随寄主植物种子、苗木等进行国际间传播,特别是这些寄主带有传毒介体时更容易传播该病毒。 A.6 粒体形态 病毒粒子球形,表面有一层膜包裹,膜外面由厚5nm、几乎连续的突起层组成,粒体直径80nm~120nm。 3GB/T31802—2015 A.7 基因组特征 三分体基因组,基因组总长为16600nt。ssRNA-L长8897nt,为负义;ssRNA-M长4821nt,为 双义;ssRNA-S长2916nt,为双义。 4GB/T31802—2015 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1 试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的番茄斑萎病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的特异性的番茄斑萎病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP) B.1.4 包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 叠氮钠(NaN3) 0.20g 蒸馏水定容至1L,4℃储存。 B.1.5 PBST缓冲液(pH7.4) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.15g 氯化钾(KCl) 0.2g 吐温-20(Tween-20) 0.5mL 叠氮钠(NaN3) 0.2g 蒸馏水定容至1L。 B.1.6 样品抽提缓冲液(pH7.4) PBST 1L 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g PVP(MW24000~40000)20.0g 叠氮钠(NaN3) 0.20g 4℃储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) PBST 1L BSA(牛血清白蛋白) 2.0g 5GB/T31802—2015 PVP(MW24000~40000)20.0g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 4℃储存。 B.1.8 底物缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺 97mL 氯化镁(MgCl2) 0.1g 叠氮钠(NaN3) 0.2g 溶于800mL蒸馏水中,用盐酸调pH至9.8,然后用蒸馏水定容至1L。4℃储存。 B.2 试验步骤 B.2.1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100μL。酶联板加盖或用保鲜膜 包好,放在37℃孵育2h。清空孔中溶液,用PBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍 干。再重复2次上述洗板过程。 B.2.2 样品制备和加样 待测样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,在研钵中研磨,2000r/min离心10min,上清液 即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。向酶联板中加入制备好的 检测样品、阴性对照、阳性对照,100μL/孔,酶联板加盖或用保鲜膜包好,放在4℃孵育过夜。酶联板用 自来水彻底冲洗,再用PBST洗涤3次,每次3min。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液,按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,加入到酶联板中,100μL/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,放在37℃孵育4h。酶联板用自来水彻底冲洗,再用PBST洗涤3次,每次 3min。 B.2.4 加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100μL/孔加入到酶联板中, 室温避光孵育。 B.2.5 读数 在不同的时间内如30min、60min、90min、120min或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值。 B.3 结果判定 对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即:缓冲液孔和 阴性对照孔的OD405值<0.15,当阴性对照孔的OD405值<0.05时,按0.05计算;阳性对照OD405值/阴 性对照OD405值>5;同一样品的重复性基本一致。 在满足了上述的质量要求后,结果原则上可判断如下:样品OD405值/阴性对照OD405值明显>2,判 为阳性;样品OD405值/阴性对照OD405值在2左右时,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以 验证;样品OD405值/阴性对照OD405值明显<2,判为阴性。 若满足不了上述的质量要求,则不能进行结果判断。 6GB/T31802—2015