ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31798—2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPlenodomusbiglobosus (Shoemaker&H.Brun)Gruyter,Aveskamp&Verkley 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、华中农业大学。 本标准主要起草人:赵晖、王振华、曾宪东、易建平、李彬、李国庆、吴品珊、蔡翔。 ⅠGB/T31798—2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了油菜黑胫病菌(Plenodomusbiglobosus)的检疫鉴定方法。 本标准适用于油菜种子、植株及其产品中油菜黑胫病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 仪器设备和主要试剂 3.1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成 像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器。 3.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,试验用水符合GB/T6682。 3.2.1 1%次氯酸钠 3.2.2 DNA提取试剂:DNA提取试剂盒,异丙醇,无水乙醇。尿素提取液(7mol/LUrea、50mmol/L Tris-HClpH8.0、62.5mmol/LNaCl、1%SDS),蛋白酶K(20mg/mL),苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇 (25∶24∶1)溶液,3mol/LNaAc(pH5.2)。 3.2.3 PCR试剂:10×PCR缓冲液(含25mmol/LMgSO4),Taq酶,dNTPs。 3.2.4 凝胶电泳试剂:琼脂糖,TAE,Loading缓冲液,EB。 3.2.5 20%V8培养基:V8蔬菜汁(CampbellSoup公司)200mL,CaCO30.75g,琼脂粉13.0g,蒸馏 水定容至1000mL,调整pH至5.8,121℃高压灭菌20min。 3.2.6 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯浸粉5.0g,葡萄糖20.0g,氯霉素0.1g,琼脂13.0g,蒸 馏水定容至1000mL,调整pH至5.6,121℃高压灭菌20min。 4 病菌的鉴定 4.1 症状检查 4.1.1 种子症状检查 取样品量1%~5%(若样品少可适量增大比例)的种子,在解剖镜下挑选皱缩、干瘪、变色、残缺的 种子或有霉变的籽粒或病残体,每份种子样品挑选不少于500粒,用做病原菌的分离。另取1kg种子, 1GB/T31798—2015 用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛,取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取。 4.1.2 植株症状检查 取病变的植株的茎根部和叶部进行检查。主要检查茎根部和叶部。选取叶片上出现圆形或不规则 形、稍凹陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色 斑,或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点,或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位(参见附录A)。 4.2 分离培养 4.2.1 种子病原菌的分离培养 将挑选的疑带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理1d,转入-20℃下冷冻处理1d,1%次氯 酸钠消毒5min~7min,无菌水洗涤3次后,用滤纸吸干种子,按25粒/皿置于V8培养基或PDA培养 基上,在20℃~25℃,12h黑暗/12h光照(12h光暗交替)条件下培养,第3天开始观察。 4.2.2 植株病原菌的分离培养 用解剖刀取植株病健交界处的组织,剪成约0.4cm×0.4cm小段,用1%的次氯酸钠溶液消毒 5min,无菌水洗涤3次,灭菌滤纸吸干水分后置于V8脂培养基或PDA培养基上,同6.2.1培养观察。 4.3 鉴定特征 该病菌在培养基上可良好生长,气生菌丝发达,产孢量大。后期(15d)可见到明显的孢子座和粉红 色的孢子溢出。气生菌丝呈白色或微黄,后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴。分生孢子呈长杆 形或梭形,长度在2.5μm~3.0μm之间,宽度在0.8μm~1.1μm之间。在孢子的两端各有一个透明的 小液滴。PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色。该病菌在PDA上产生黄褐色色素。 4.4 PCR检测 4.4.1 样品DNA提取 取筛上物、筛下物和种子,或植株可疑病变组织各1g~2g,液氮研磨后各取样0.1g~0.2g,采用 商业化试剂盒或尿素法提取DNA(参见附录B)。 4.4.2 PCR检测方法 PCR检测方法参见附录C,重复3次。用油菜黑胫病菌(Plen.biglobosus)参照菌株DNA作阳性 对照,用灭菌蒸馏水作空白对照。 5 结果判定 病菌的分离培养形态特征符合4.3中描述,可报告检出油菜黑胫病菌。PCR检测作为筛选和辅助 方法。 6 样品保存与结果记录 6.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出油菜黑胫病菌的样品应保存于4℃冰箱中,以备复 核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 2GB/T31798—2015 6.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为油菜黑胫病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于V8培养基或PDA 培养基斜面上,20℃~25℃培养5d,然后4℃冰箱保存,或将菌丝块转入20%灭菌甘油并混匀, -80℃长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 6.3 结果记录与资料保存 完整的试验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并应有试验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片。 3GB/T31798—2015 附 录 A (资料性附录) 油菜黑胫病菌相关信息 A.1 背景资料 A.1.1 油菜黑胫病菌基本信息 中文名:油菜黑胫病菌。 学名:Plenodomusbiglobosus(Shoemaker&H.Brun)Gruyter,Aveskamp&Verkley。 异名:LeptosphaeriabiglobosaShoemaker&H.Brun。 分类地位:真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),格孢腔菌目 (Pleosporales),小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)。根据对油菜的侵染能力不同,分为强致病性菌株和 弱致病性菌株,2001年前均命名为Leptosphaeriamaculans。2001年,Shoemaker和Brun根据传统的 分类学原则将对油菜弱致病性的菌株定为LeptosphaeriabiglobosaShoemaker&Brun。2012年, Gruyter等根据分子和系统发育特征将该菌重新分类命名为Plenodomusbiglobosus(Shoemaker&H. Brun)Gruyter,Aveskamp&Verkley。 传播途径:感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播的主要途径。 A.1.2 方法原理 根据油菜黑胫病菌在寄主上的为害症状,培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器形态, 以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定。 A.1.3 寄主范围 该病菌的寄主广泛,主要有如油菜、甘蓝、花椰菜等芸苔属Brassica,萝卜属Raphanus,独行菜属 Lepidium,香雪球属Lobularia,屈曲花属Iberis,碎米荠属Cardamine,紫罗兰属Matthiola,糖芥属 Erysimum,团扇荠属Berteroa,葱芥属Alliaria等植物。 4GB/T31798—2015 A.2 感病植株的症状、病菌形态特征图 说明: a———叶片为害状; b———茎基部为害状; c———根部为害状; d———后期菌丝上分泌出淡黄棕色的油状液滴; e———病菌在PDA上产生黄褐色色素; f———分生孢子。 注:图片来自李国庆等。 图A.1 感病植株的症状、病菌形态特征图 5GB/T31798—2015 附 录 B (资料性附录) 油菜黑胫病菌DNA的提取方法 B.1 试剂盒提取DNA的方法 B.1.1 将植物样品用液氮碾碎。 B.1.2 按照试剂盒提供的操作步骤处理。 B.2 尿素法提取菌丝DNA的方法 B.2.1 取500μL尿素提取液(7mol/LUrea、50mmol/LTris-HClpH8.0、62.5mmol/LNaCl、1% SDS)与10μL20mg/mL蛋白酶K至EP管中,挑取200mg菌丝至EP管,混匀。 B.2.2 置55℃温育30min,每隔10min振荡混匀1次,12000r/min离心5min,将上清液移入另一 EP管中,加入等体积的苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)溶液,颠倒混匀,13000r/min离心 10min。 B.2.3 取上清液到另一EP管中,加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mo