ICS65.020.010 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31796—2015 南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆 猝死综合症病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofFusariumtucumaniaeand Fusariumvirguliforme 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:吴品珊、王颖、章桂明、陈枝楠。 ⅠGB/T31796—2015 南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆 猝死综合症病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于田间大豆和大豆粒携带的土壤和病残体中南、北美大豆猝死综合症病菌的鉴定。 2 仪器和用具 2.1 仪器 生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平(1/1000g)、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、荧光 PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、摇床。 2.2 用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杵、 移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐。 3 试剂和培养基 3.1 试剂 琼脂粉,马铃薯,葡萄糖,乳酸,琼脂糖,无菌双蒸水,液氮,蛋白胨,磷酸二氢钾,硫酸镁,链霉素,新 霉素,五氯硝基苯,氯四环素,利福平,Tris-HCl,MgCl2,HCl,EDTA,NaOH,NaOAc,KCl,Tris, CTAB,TAE,无水乙醇(Ethanol),苯酚(Phenol),溴化乙锭(EB),三氯甲烷(Chloroform),异丙醇 (Isopropanol),异戊醇(Isoamylalcohol),蛋白酶K,TaqDNA聚合酶,dNTP,DNA相对分子质量标准 物,双重PCR特异性引物Fu1/2和Fsg-α-1/2,实时荧光PCR特异性引物及探针16-FP/16-RP和 16-AG,TaqManUniversalPCRMasterMix。 3.2 培养基 0.2%水琼脂培养液,选择性培养基PCNB,马铃薯葡萄糖培养基(PDA),低营养合成培养基 (SNA)。具体配方参见附录A。 4 检疫鉴定方法 4.1 症状检查 南、北美大豆猝死综合症在症状上区别不大,病害典型的症状是叶片的叶肉枯黄坏死,叶脉有时保 持绿色,根部维管束组织有褐色病变,髓部白色。参见附录A病害症状描述。 采集田间疑似症状大豆植株的根部、植株周围的土壤,备用。在大豆粒中筛选其携带的土壤,并挑 选其中混杂的病残体,尤其是大豆的地下部分根,备用。 1GB/T31796—2015 4.2 分离培养 将土壤样品每份取2g放入100mL0.2%的水琼脂培养液中,摇床摇动、混匀20min,用无菌水将 培养液分别稀释10倍和20倍,分别取1mL土壤稀释液涂抹于选择性培养基PCNB平板上。每处理 5个重复,23℃光照培养,4d~7d后观察菌落的产生情况。 将病残体切取边长为5mm~10mm的见方小块,70%乙醇表面消毒10s~30s,放置在选择性培 养基PCNB上,20℃12h光照/12h黑暗培养1周~2周。 4.3 形态学鉴定 如在选择性培养基PCNB上观察到真菌菌落的形成,转接到PDA上,20℃12h光照/12h黑暗或 自然光线下培养,3d~5d后开始观察记录病菌的培养性状,显微镜下观察记录分生孢子的形状和 大小。 如PDA上有疑似菌落出现,转到SNA上20℃黑暗培养,显微镜下观察记录分生孢子的形状和 大小。 4.4 分子生物学检测 4.4.1 DNA提取 收集分离到的真菌菌丝,采用CTAB方法提取DNA,参见附录B。 4.4.2 双重PCR检测 北美大豆猝死综合症病菌(Fusariumvirguliforme)的双重PCR特异性引物为:Fu1:5'-GGAGGG ATCATTACCGAGTT-3',Fu2:5'-TTCCAGTTGCGAGGTGTTA-3',Fsg-α-1:5'-AGTCGACCACCGTAAG TCG-3',Fsg-α-2:5'-GATCAGGGCTTTGTCCAAC-3'。 反应体系(25μL):10×PCR缓冲液3μL,25mmol/LMgCl22μL,10mmol/LdNTP0.5μL, 10μmol/LFu1/2引物各0.8μL,10μmol/LFsg-α-1/2引物各1.0μL,TaqDNA聚合酶1U,模板 DNA4ng,加灭菌双蒸水至25μL。 反应条件:94℃,5min变性处理后,经30个循环(94℃,1min;55℃,30s;72℃30s),72℃延伸 10min。 1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,凝胶成像系统观察电泳结果。 4.4.3 荧光PCR检测 南美大豆猝死综合症病菌(Fusariumtucumaniae)荧光PCR引物及探针序列为:16-FP: CCAGTGGTGCGGAAGGTA,16-RP:GACGGCGATTCCAACAGTAG,16-AG:JUP-ACCCTAGAG CTCGTCTT-JUP。 反应体系(10μL):实时荧光反应混合液5μLTaqManUniversalPCRMasterMix,0.3μL各引物 (10μmol/L),0.3μL探针(10μmol/L),1μLDNA(10ng/μL),无菌双蒸水3.1μL。将反应体系混匀, 离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应,每个反应重复2次。以无菌双蒸水作空白对照,阳性对照以 南美大豆猝死病菌DNA为模板,阴性对照以大豆上其他镰刀菌DNA为模板。 反应条件为50℃预热2min,95℃变性10min,然后进入循环反应:95℃变性15s,60℃延伸 1min,共40次循环。 2GB/T31796—2015 5 鉴定特征 5.1 培养性状 南、北美大豆猝死综合症病菌在菌落培养形状上区别不大。 南、北美大豆猝死综合症病菌的菌落在选择性培养基PCNB上4d~7d可显现。特征是生长速度 较缓慢,直径小,一般为0.5cm~0.9cm;颜色为白色,中心有时为浅黄色突起;形状为圆形、星型或放射 状;菌落微隆,表面为粉笔末的颗粒状,较致密,无气生菌丝覆盖。 南、北美大豆猝死综合症病菌在PDA上菌落通常为蓝绿色、灰绿色、浅绿色或蓝色,偶尔黄白色, 菌落边缘为灰白色,缺乏气生菌丝。随着菌落的年龄增长,颜色由蓝绿色变化为蓝紫色或深绿色。 5.2 病菌形态 南美大豆猝死综合症病菌(F.tucumaniae)菌丝在SNA上宽1μm~5μm(~14μm),厚垣孢子形 成在菌丝和分生孢子上,通常在末端,偶尔在中间形成,亚球型、单个,无色至白色、黄灰或白黄,外表光 滑至粗糙,有时有小疣,大小(8μm~20μm)×(10μm~20μm)。F.tucumaniae在荧光或自然光培养 的PDA上,菌落蓝绿色,黑暗条件下为浅色,产孢快速且丰富。SNA和PDA上的分生孢子座都很丰 富,但PDA上很少有菌丝链。气生的分生孢子梗在SNA上丰盛,通常无分枝或零星分枝,长230μm, 宽2μm~2.5μm,形成单瓶梗粘在顶部,气生瓶梗钻型到近圆柱型。气生分生孢子有两种类型,第一种 是弯柱状到镰刀形,2~5隔膜,有足细胞,与镰刀形的分生孢子座的分生孢子形态区分明显,主要形成 在较高的分生孢子梗上;第二种分生孢子微小、卵圆、0~1分隔,大小范围(4.5μm~13μm)×(2μm~ 3.5μm),平均(6.6μm~7.7μm)×(2.4μm~2.7μm),在菌落的一小部分上形成,长在高50μm、宽 2μm~3μm的短分生孢子梗上。 F.tucumaniae分生孢子座的分生孢子梗轮状分枝或很少分枝,顶部生成单瓶梗,分生孢子座瓶梗 简单、钻形、安锫瓶形,顶端通常有个显著的囊领。分生孢子座的分生孢子通常圆柱形、微弯,有时镰刀 形,背部和腹部线条接近平行,有尖锐的顶部细胞和明显的足细胞,(2~)3~4(~6)隔膜。SNA上3隔 膜大型分生孢子大小范围为(38μm~72.5μm)×(4μm~6.5μm),平均(52.2μm~63.3μm)× (4.7μm~4.9μm),在PDA上,大小范围(34.5μm~71μm)×(4μm~5.5μm),平均(55.0μm~ 58.3μm)×(4.7μm~4.9μm),SNA上4隔膜大型分生孢子大小范围为(50.5μm~81μm)×(4μm~ 5.5μm),平均(62.5μm~67.3μm)×(4.8μm~5.0μm),PDA上(55μm~77.5μm)×(4μm~ 5.5μm),平均(58.0μm~61.4μm)×(4.7μm~5.0μm),SNA上5隔膜大型分生孢子大小范围 (57.5μm~88.5μm)×(3.5μm~6μm),平均(65.3μm~74.1μm)×(4.8μm~5.1μm)。第二种分生 孢子座孢子或缺乏,短棍棒状、椭圆形或舟形,直或微弯,有一个圆的顶端和平截的基部,0~1分隔, [20μm~27μm(~51.5μm)]×(2.5μm~6μm),在PDA上偶尔形成链状。 北美大豆猝死综合症病菌(F.virguliforme)在20℃黑暗条件下PDA上的菌落每日生长速度为 1.4mm~1.6mm,黑暗条件下PDA上的菌落白色或黄白色,有时有蓝灰色色素,分生孢子的疣突浅黄 色;在荧光和日光