ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31792—2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofDiaporthehelianthiMuntanola-Cvetkovic MihaljcevicetPetrov 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中国合格评定国家认可中心、中华人民共和国新疆出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人:吴品珊、杜洪忠、蔡露敏、张祥林、严进。 ⅠGB/T31792—2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了向日葵茎溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于向日葵植株和种子中向日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定。 2 仪器和用具 2.1 仪器 体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平(1/1000g)、高压灭菌锅、冰箱、PCR 扩增仪、荧光PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。 2.2 用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杵、 移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、样品筛(10目,ϕ1.7mm)。 3 试剂和培养基 3.1 试剂 葡萄糖,链霉素,乳酸,琼脂,1.0%次氯酸钠(NaClO),液氮,Tris-HCl,MgCl2,HCl,EDTA,NaOH, NaOAc,KCl,Tris,CTAB,TAE,无水乙醇(Ethanol),三氯甲烷(Chloroform),异丙醇(Isopropanol),异 戊醇(Isoamylalcohol),SYBRGreenⅠ核酸染料,蛋白酶K,TaqDNA聚合酶,dNTP,通用引物ITS5 和ITS4,实时荧光PCR特异性引物DH-F、DH-R及探针DH-Pr。 3.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),链霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基(SPDA)。具体配方参见附 录A。 4 检疫鉴定方法 4.1 症状检查 采集田间疑似症状的茎杆、病叶或葵盘,剪取病健交界处的组织材料备用。病害典型的症状是茎杆 和叶柄处有淡褐色溃疡病斑,详见附录A病害症状描述。 在种子中挑选干瘪、变色、皱缩、残缺或霉变的种子,同时挑选其中夹带的向日葵残体,如叶柄、茎 杆、花盘碎片等。 4.2 分离培养 将有疑似症状的叶片、叶柄、茎杆、花盘碎片等样品在病健交界处剪取5mm~10mm的小块,用 1GB/T31792—2015 1%次氯酸钠表面消毒5min~10min,灭菌水冲洗3次,用灭菌滤纸将水吸干后,置于含链霉素的 SPDA培养基平皿中,25℃、8h光照/16h黑暗条件下培养,3d~5d后开始观察。 将种子样品用1%次氯酸钠表面消毒5min~10min,灭菌水冲洗3次,保持无菌状态,在室温25℃ 下放置24h,再在-20℃下冷冻24h,然后转至含链霉素的SPDA培养基平皿中,25℃、8h光照/16h 黑暗条件下培养,3d~5d后开始观察。 有种衣剂的种子,先将种衣剂洗掉(参见附录A),再进行上述操作。 4.3 生物学鉴定 如在SPDA培养基上观察到真菌菌落,转接到PDA培养基平皿上纯化培养,5d~7d后开始观察 记录病菌的培养性状,显微镜下观察记录分生孢子和分生孢子器的形态和大小。 4.4 分子生物学检测 4.4.1 DNA提取 收集分离到的真菌菌丝,采用CTAB方法提取DNA(参见附录B)。 4.4.2 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR引物序列为DH-F:5'-CGCTTATCTCTTACACCAAAACCCT-3',DH-R: 5'-GCAGCTATTGAAACAGCTCATCTG-3',TaqMan探针DH-Pr:5'-FAM-ATGCACCCACCGCA CTCCTGC-BHQ-1-3'。探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1。 反应体系(25μL):样品DNA1μL,10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/LMgCl22μL,2.5mmol/L dNTPs2μL,10μmol/LPrimers各1μL,10μmol/L探针DH-Pr1.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.3μL,ddH2O13.7μL。以无菌双蒸水作空白对照,阳性对照以向日葵茎溃疡病菌DNA为模板,阴性 对照以向日葵上其他真菌DNA为模板。 反应循环为:94℃10min;94℃15s、56℃60s,40个循环。 4.4.3 ITS基因检测和序列比对 可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法。 可利用真菌通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCTC- CGCTTATTGATATGC-3')进行扩增。 25μL反应体系(25μL):样品DNA1μL(1ng~50ng),10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/L MgCl22μL,2.5mmol/LdNTPs2μL,10μmol/LPrimers各0.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶 0.2μL,ddH2O16.3μL。同时设置阴性对照,以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。 PCR反应条件为:94℃4min;95℃1min、56℃30s、72℃45s,35个循环;72℃10min;4℃ 保存。 PCR产物的检测在1×TAE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖(含SYBRGreenⅠ核酸染料)凝胶电泳, 5V/cm,凝胶成像仪分析结果。如有500bp左右大小的条带出现,将扩增产物进行序列测定。 将测序后的序列与NCBI网站GenBank中公开发表的Diaporthehelianthi的序列进行BLAST 分析。 5 鉴定特征 5.1 培养性状 向日葵茎溃疡病菌在PDA培养基上生长,菌落初期为白色,菌丝体较密集,两周后渐渐变为褐色 2GB/T31792—2015 至深褐色,其间形成暗褐色分生孢子器,菌落形态图参见附录C。 5.2 病菌形态 向日葵茎溃疡病菌的菌丝分隔,分生孢子器聚生或散生,浅褐色、褐色至黑色,球形或扁球形,直径 120μm~450μm,含有α和β两种类型的分生孢子。α分生孢子无色、单胞,纺锤形或椭圆形,常有 2个~4个油滴,大小为(8μm~21μm)×(1.7μm~5.5μm);β分生孢子无色、单胞,丝状线形,一端常 为钩状,无油球,大小(16μm~42μm)×(0.5μm~6.9μm)。 病菌在植物残体上形成有性器官。子囊壳直径350μm~450μm,有喙状突起长350μm~ 600μm;子囊无色,大小(44μm~67μm)×(7.5μm~12.5μm),含8个子囊孢子;子囊孢子双胞、无色、 椭圆形,大小(12.5μm~19μm)×(2.8μm~7.5μm)。 向日葵茎溃疡病菌的α型分生孢子、β型分生孢子的形态图参见附录C。 5.3 实时荧光PCR检测 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下: ———Ct值小于或等于36,判定阳性; ———Ct值大于或等于40,判定阴性; ———Ct值在36~40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后如Ct值小于或等于36,或者Ct值大 于或等于40,判定同上。 5.4 ITS序列比对 经BLAST分析,PCR扩增到的ITS基因序列与NCBI网站GenBank中登录号为FJ841862.1的 Diaporthehelianthi的序列同源性为99%~100%,则判定为阳性。 6 结果判定 病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致,且实时荧光PCR检测结果呈阳性,或ITS序 列比对99%~100%同源,可判定为向日葵茎溃疡病菌。 7 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出向日葵茎溃疡病菌的样品应保存于4℃冰箱中,以 备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 8 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为向日葵茎溃疡病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基 斜面上,20℃培养5d,4℃~8℃黑暗条件下保存,定期(60d)转接,至少保存6个月。必要时用病菌 的分生孢子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭菌灭活处理。 9 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字。 3GB/T31792—2015 附 录 A (资料性附录) 向日葵茎溃疡病菌的其他信息 A.1 背景资料 A.1.1 病菌基本信息 英文名:stemcankerofsunflower,stalkrotofsunflower 学名:DiaporthehelianthiMuntanola-CvetkovicMihaljcevicetPetrov 无性态:Phomopsishelianthi 分类地位:真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),粪壳菌纲(Sordariomycetes),间座壳目 (Diaporthales),间座壳科(Diaporthaceae)。 传播途径:向日葵茎溃疡病菌近距离传播主要是病菌孢子借助雨水飞溅、病残体以及农事操作工具 传播,远距离传播主要通过种子和种子中夹带的病残体传播。 A.1.2 方法原理 根据向日葵茎溃疡病菌的菌落性状、形态学特征和目标片段的序列特征为鉴