ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31790—2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofPotatospindletuberviroid 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民 共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒 苗木研究所、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:张永江、刘洪义、刘忠梅、辛言言、陈慧、陈红运、马洁、吕典秋、沈建国、廖富荣、 文朝慧、张成标、吴兴海。 ⅠGB/T31790—2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带有马铃薯纺锤块茎类病毒的马铃薯组织材料的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18133 马铃薯种薯 SN/T2481 进境马铃薯种薯检疫操作规程 3 仪器设备、用具及试剂 3.1 仪器设备 电子分析天平(0.001g)、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪、实时荧光PCR 仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、 涡旋振荡器、微波炉等。 3.2 用具 可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)、吸头、离心管(0.2mL、0.5mL、1.5mL)及研 钵等。 3.3 试剂 除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。 R-PAGE试剂见附录B;RT-PCR试剂见附录C;实时荧光RT-PCR试剂见附录D。 4 检测方法 4.1 样品制备 4.1.1 脱毒苗制样:对脱毒苗要逐株制样,在无菌条件下,从脱毒苗上剪下长2cm的茎段,放于小研钵 中,用于提取核酸并进行后续检测;把取样的脱毒苗放回试管中,封好管口并编号,以便根据检测结果决 定取舍。 4.1.2 种薯制样:在隔离种植前对种薯块茎进行症状检查,对有明显症状的薯块,直接取症状部位0.2g~ 0.5g用于核酸提取并进行后续检测;对于无明显症状的薯块进行隔离种植。 4.1.3 隔离种植植株制样:种薯隔离种植按照SN/T2481的规定执行,生长温度应至少高于18℃(更 1GB/T31790—2015 适宜的温度是高于20℃)和至少16h的光周期。在生长期间进行严格的症状检查,症状参见附录A。 在花期或接近花期时,对可疑症状的植株,每株采取植株顶部完全展开的叶片0.2g~0.5g单独制样, 用于核酸提取并进行后续检测;如果没有发现可疑症状,可5株混合采样用于核酸提取并进行后续 检测。 4.1.4 田间植株制样:对田间生长的植株作整体观察后,对症状可疑的植株,每株采集症状叶片0.2g~ 0.5g单独制样,进行核酸提取并进行后续检测;如果没有发现可疑症状,则按GB/T18133的要求每 5株混合采样,进行核酸提取并进行后续检测。 4.2 R-PAGE测定 R-PAGE测定见附录B。 4.3 RT-PCR检测 RT-PCR检测见附录C。 4.4 实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测见附录D。 5 结果判定 显症马铃薯样品经4.2、4.3及4.4中的一种方法检测为阳性,则判定样品携带PSTVd;无症马铃薯 样品经单一方法检测为阳性,需不同原理的检测方法确认一次,两次结果均为阳性,则判定样品携带 PSTVd。 6 样品保存与结果记录 6.1 样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并作好登记和标记,以备复核用。保存期满后,需经灭活处理。 6.2 结果记录 完整的试验记录应包括:样品的来源、种类、时间,试验检测时间、地点、方法和结果,并有试验人员 的签字;种薯隔离种植的显症植株应有显症照片;R-PAGE测定应有银染色结果图片,RT-PCR检测应 有电泳结果图片,实时荧光RT-PCR检测应有扩增曲线结果图片。 2GB/T31790—2015 附 录 A (资料性附录) 马铃薯纺锤块茎类病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息 学名:Potatospindletuberviroid。 缩写:PSTVd。 异名:Potatopindletubervirus、Potatogothicvirus和Tomatobunchytopvirus。 分类地位:马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)。 传播途径:远距离传播主要通过国际间或地区间种薯贸易;田间可通过机械接触及被感染的农机具 等进行传播。 A.1.2 方法原理 根据PSTVd在寄主植物上的症状进行初步判定;根据其RNA自然状态和变性后的不同结构分子 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(return-polyacrylamidegel electrophoresis,R-PAGE)检测;根据其基因组特征进行常规RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测,通过 电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。 A.2 寄主范围 自然寄主有马铃薯(Solanumtuberosum)、番茄(Lycopersiciesculentum)、鳄梨(Perseaamericana)、人 参果(Solanummuricatum)、曼陀罗(Daturastramonium)、素馨叶白英(Solanumjasminoides)、蓝花 茄(S.rantonnetii)、果酱木(Streptosolenjamesonii)和灯笼果(Physalisperuviana)。人工接种寄主有 31属94种。 鉴别寄主:常用的鉴别寄主有鲁特格尔斯番茄(Lycopersiconesculentumcv.Rutgers)和茛菪 (Scopoliasinensis)。 A.3 地理分布 北美洲:美国(堪萨斯、缅因、马里兰、密西根、纽约、威斯康星)、加拿大(阿尔伯特、哥伦比亚、新布伦 斯维克、安大略、爱德华岛、魁北克)。 欧洲:捷克、法国、德国、匈牙利、荷兰、波兰、斯洛伐克、瑞士、土耳其、英国、苏格兰、前苏联。 南美洲:阿根廷、乌拉圭、巴西、秘鲁、古巴。 非洲:南非、尼日利亚。 亚洲:阿富汗、印度、日本、中国(河北、黑龙江、江苏)。 大洋洲:澳大利亚(新南威尔士、维多利亚)。 3GB/T31790—2015 A.4 传播途径 被感染的繁殖材料如实生种子及种薯等是远距离传播的主要途径;田间可通过机械接触、汁液接 种、农民的衣物、被感染的农机具及切取块茎的切刀等进行传播。咀嚼式昆虫的传播已有报道,但还未 定论。当PSTVd和马铃薯卷叶病毒(Potatoleafrollvirus,PLRV)混合侵染时,PSTVd可通过蚜虫 传播。 A.5 症状特征 PSTVd侵染马铃薯引起的症状表现与其株系、栽培品种品系及环境条件有关。PSTVd可以引起 植株矮化,茎秆直立僵硬,叶片叶柄与主茎的夹角变小,呈半闭半合状和扭曲,叶片叶柄常呈锐角形态向 上竖起。有的全株失去润泽的绿色,有的从上方观察叶子是暗绿色和皱缩的;有的顶部叶片变小、卷曲、 耸立,有的感病植株不表现症状(见图A.1)。块茎变小,畸形,有的顶端变尖,圆形的块茎变长,有的表 面开裂,有的芽眼突出,典型的块茎症状为纺锤形或哑铃形(见图A.2)。 A.6 基因组特征 PSTVd是一种含356个~351个核苷酸、具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合 环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为开环状分子,这种开环状的RNA分子在聚丙 烯酰胺凝胶电泳中迁移率比相同相对分子质量的线状分子要慢得多。 图A.1 受马铃薯纺锤块茎类病毒侵染的马铃薯植株症状 4GB/T31790—2015 注:从左向右三个块茎是感染PSTVd的症状,表现为纺锤形;最右边的一个块茎是健康对照。 图A.2 受马铃薯纺锤块茎类病毒侵染的马铃薯块茎症状 注:图A.1和图A.2引自EPPOStandardsPM7/33.Potatospindletuberpospiviroid。 5GB/T31790—2015 附 录 B (规范性附录) 往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(R-PAGE) B.1 试剂与材料 以下所用试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂,水为符合GB/T6682中规定的一级水。 B.1.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)溶液(pH8.0) 称取乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)186.1g,溶于700mL水中,用氢氧化钠(NaOH)调 pH至8.0,加水定容至1000mL。 B.1.2 水饱和酚(pH4.0) B.1.3 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水 在100mL水中,加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50