ICS65.160 X87 中华人民共和国国家标准 GB/T31758—2015 烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定 高效液相色谱法 Determinationofsolanesolintobaccoleavesandtheextractsoftobaccoleaves— Highperformanceliquidchromatographymethod 2015-07-03发布 2015-11-02实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国烟草标准化技术委员会(SAC/TC144)归口。 本标准起草单位:福建省农业科学院中心实验室、福建省三明金叶复烤有限公司、福建中烟工业有 限责任公司、陕西中烟工业有限责任公司。 本标准主要起草人:潘葳、刘文静、罗钦、张望兴、谢卫、刘泽春、黄朝章、张建平、雷东锋、王健强、 涂杰峰、余华。 ⅠGB/T31758—2015 烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了烟叶及烟叶提取物中游离茄尼醇和总茄尼醇含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于烟叶及烟叶提取物中游离茄尼醇和总茄尼醇含量的测定。 本方法测定烟叶中游离茄尼醇和总茄尼醇含量的检出限为0.0013mg/g,定量限为0.0043mg/g; 烟膏中游离茄尼醇和总茄尼醇含量的检出限为0.013mg/g,定量限为0.043mg/g;提取液中游离茄尼 醇和总茄尼醇含量的检出限为0.000052mg/g,定量限为0.00017mg/g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 YC/T31 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法 3 原理 用正己烷提取烟叶中游离茄尼醇,用水除去杂质,离心分离,取上层溶液用流动相稀释定容,经微膜 过滤后高效液相色谱仪测定,外标法定量。测定总茄尼醇时需用氢氧化钠皂化以释放出结合态的茄 尼醇。 4 试剂与材料 4.1 正己烷(C6H14)。 4.2 甲醇(CH4O):色谱纯。 4.3 异丙醇(C3H8O):色谱纯。 4.4 氢氧化钠(NaOH)。 4.5 无水乙醇(C2H6O)。 4.6 茄尼醇标准品:纯度≥98%。 4.7 NaOH乙醇溶液(0.02mol/L):称取0.4g氢氧化钠(4.4),溶于无水乙醇(4.5),用无水乙醇稀释至 500mL,贮存于聚乙烯瓶中,旋紧瓶盖。 4.8 流动相:甲醇(4.2)∶异丙醇(4.3)=70∶30(体积比),使用前经滤膜(5.1)过滤。 4.9 茄尼醇标准储备溶液(0.50mg/mL):称取50mg茄尼醇标准品(4.6),置于100mL容量瓶(5.9) 中,精确至0.0001g,用正己烷(4.1)溶解并定容至刻度,混匀。标准储备溶液避光保存于4℃冰箱备 用,有效期3个月。 4.10 茄尼醇系列标准工作溶液:分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL茄尼醇标准 储备溶液(4.9)于不同的50mL容量瓶(5.9)中,用流动相(4.8)稀释并定容至刻度,摇匀,得到茄尼醇系 1GB/T31758—2015 列标准工作溶液(质量浓度分别为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)。 该茄尼醇系列标准工作溶液应即配即用。 4.11 除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水应符合GB/T6682中一级水的要求。 5 仪器和设备 5.1 滤膜:0.22μm,直径25mm的聚砜膜或相当者。 5.2 涡旋振荡器。 5.3 超声波清洗器:功率不低于250W,或相当的设备。 5.4 离心机:不低于4000r/min,或相当的设备。 5.5 恒温振荡器:可水浴加热(0℃~100℃)。 5.6 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.7 电子天平:感量0.0001g。 5.8 离心管:50mL(螺旋盖),10mL(具塞)。 5.9 容量瓶:100mL,50mL,25mL(棕色)。 5.10 三角瓶:100mL(具塞、棕色)。 6 分析步骤 注:本章所述的操作尽可能避免阳光直射。 6.1 样品前处理 6.1.1 烟叶 6.1.1.1 试样制备 按照YC/T31制备试样并测定其水分含量。 6.1.1.2 提取 称取约1g试样(6.1.1.1)于50mL离心管(5.8)中,精确至0.0001g,加入30mL正己烷(4.1),用 涡旋振荡器(5.2)涡旋振荡2min,旋紧盖子,静置12h后,用超声波清洗器(5.3)于45℃超声波萃取 15min,萃取功率为250W,用离心机(5.4)4000r/min离心10min,将上层溶液移入50mL容量瓶 (5.9)中。再分2次各用10mL正己烷(4.1)重复以上振荡、萃取和离心步骤,合并上层正己烷层于 50mL容量瓶(5.9)中,用正己烷(4.1)定容至刻度,摇匀。 6.1.1.3 游离茄尼醇测定试样处理 移取4mL提取液(6.1.1.2)于10mL离心管(5.8)中,加入约6mL蒸馏水,涡旋振荡3min,去除水 溶性杂质,4000r/min离心10min分层。 准确移取1mL净化后上层正己烷提取液,用流动相(4.8)稀释并定容至25mL容量瓶(5.9)中(如 茄尼醇浓度超出标准曲线线性范围,则适当调整分取体积和定容体积),经滤膜(5.1)过滤,滤液待上机 测定。 6.1.1.4 总茄尼醇测定试样处理 准确移取4mL提取液(6.1.1.2)于100mL三角瓶(5.10)中,加入4mLNaOH乙醇溶液(4.7),充 2GB/T31758—2015 分混匀,轻塞塞子,在恒温振荡器(5.5)中60℃~65℃水浴振荡、皂化2h;皂化后溶液在83℃~87℃水 浴蒸发至近干;准确移取2mL正己烷于上述三角瓶中,超声2min溶解残渣,转移至另一洁净10mL 离心管(5.8)中。 重复以上自“准确移取2mL正己烷”起依法操作,溶解三角瓶中残留物转移至离心管(5.8)中,再 用约6mL水,每次2mL分三次洗涤三角瓶,合并溶液于离心管(5.8)中;涡旋振荡离心管3min以去 除水溶性杂质,离心10min分层;准确移取1mL净化后上层正己烷提取液,用流动相(4.8)稀释并定容 至25mL容量瓶(5.9)中(如茄尼醇浓度超出标准曲线线性范围,则适当调整分取体积和定容体积),经 滤膜(5.1)过滤,滤液待上机测定。 6.1.2 烟叶提取物(烟膏、提取液等) 6.1.2.1 烟膏(烟叶的正己烷或石油醚提取浓缩物) 称取约0.1g烟叶提取物置于10mL烧杯中,精确到0.0001g,用正己烷溶解,转移至50mL容量 瓶(5.9)中,用正己烷定容,摇匀。同6.1.1.3和6.1.1.4测定烟膏中游离茄尼醇和总茄尼醇。 6.1.2.2 提取液(烟叶的乙醇水溶液提取浓缩物) 6.1.2.2.1 游离茄尼醇 称取约1g浓缩液,精确到0.0001g,用流动相(4.8)稀释并定容至50mL容量瓶(5.9)中。超声波 萃取10min,用离心机(5.4)4000r/min离心10min,上层清液经滤膜(5.1)过滤,滤液待上机测定。 6.1.2.2.2 总茄尼醇 准确移取4mL以上上层清液,于100mL三角瓶(5.10)中,加入4mLNaOH乙醇溶液(4.7),充分 混匀,轻塞塞子,在恒温振荡器(5.5)中60℃~65℃水浴振荡、皂化2h;皂化后溶液在83℃~87℃水 浴蒸发至近干;准确移取2mL流动相(4.8)于上述三角瓶中,超声2min溶解残渣,转移至另一洁净 10mL离心管(5.8)中。 重复以上自“准确移取2mL流动相(4.8)”起依法操作,溶解三角瓶中残留物转移合并至离心管 (5.8)中,离心10min,上层清液经滤膜(5.1)过滤,滤液待上机测定。 6.2 样品测定 6.2.1 高效液相色谱参考条件 按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪(5.6)。以下分析条件可供参考,采用其他条件应验证其 适用性: ———色谱柱:C18,150mm×4.6mm(内径),粒径3μm,或性能相当者; ———柱温:40℃; ———紫外检测波长:213nm; ———流速:1.0mL/min; ———进样体积:20μL。 6.2.2 液相色谱测定 分别取适量的茄尼醇系列标准工作溶液(4.10)及待上机试样溶液,按6.2.1列出的条件进行液相色 谱分析测定。由保留时间进行定性,根据标准工作溶液的浓度及茄尼醇响应峰面积,建立标准工作曲 线。工作曲线线性相关系数R2≥0.999。 3GB/T31758—2015 待测样液中茄尼醇的响应值应在标准曲线范围内,超过线性范围则应稀释后再进行分析。分析过 程中,每20次样品测定后应加入一个与样品峰面积相近的标准工作液,如果测得的值与原值相对平均 偏差超过5%,则应重新进行标准曲线的制作。标准样品及典型样品色谱图参见附录A。 7 结果计算与表示 7.1 结果计算 烟叶干基中茄尼醇的含量按式(1)进行计算,烟叶提取物中茄尼醇的含量按式(2)进行计算: 烟叶: X=c×V×f m×(1-w)×10-3…………………………(1) 烟叶提取物: X=c×V×f m×10-3…………………………(2) 式中: X———试样干基中茄尼醇的含量(以