ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T31582—2015 牛性控冷冻精液 Bovinefrozensexed-semen 2015-05-15发布 2015-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位:农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京)、内蒙古赛科星繁育生物技术股 份有限公司、北京奶牛中心、中国农业大学、全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心 (南京)。 本标准主要起草人:张晓霞、李喜和、周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、张海涛、刘玉、赵小丽、赵鹏、 陆汉希、王建国、胡树香、施亮、张勇、钱松晋。 ⅠGB/T31582—2015 牛性控冷冻精液 1 范围 本标准规定了牛性控冷冻精液技术要求、抽样、试验方法、判定规则和标识、包装。 本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T2828.2—2008 计数抽样检验程序 第2部分:按极限质量(LQ)检索的孤立批检验抽样 方案 GB/T2828.11—2008 计数抽样检验程序 第11部分:小总体声称质量水平的评定程序 GB4143 牛冷冻精液 GB/T5458 液氮生物容器 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 性控冷冻精液 frozensexed-semen 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。 3.2 精子分离准确率 XorYratioofsexed-semen X精子或Y精子占分离后精子总数的百分率。 4 要求 4.1 种公牛 经审定或鉴定的公牛,体质健康,无遗传病,不允许有《中华人民共和国动物防疫法》中所明确的二 类疫病中的任何一种。 4.2 新鲜精液 色泽乳白色或淡黄色,精子活力≥65%,精子密度≥4×108个/mL,精子畸形率≤15%。 4.3 每剂量解冻后精液 4.3.1 外观 细管无裂痕,两端封口严密。 1GB/T31582—2015 4.3.2 剂型、剂量 细管冷冻精液:微型,剂量≥0.18mL。 4.3.3 精子活力 ≥35%(即≥0.35)。 4.3.4 前进运动精子数 ≥80万个。 4.3.5 分离准确率 ≥85%。 4.3.6 精子畸形率 ≤15%。 4.3.7 细菌菌落数 ≤800个。 5 抽样 5.1 抽样检验方案 5.1.1 生产方抽样检验 按照GB/T2828.2—2008中第4章,采用极限质量LQ=20,模式A一次抽样方案,确定抽样公牛 样本量。 5.1.2 质量监督抽样检验 按照GB/T2828.11—2008中第6章,该群体公牛为一核查总体,采用DQL=10,选用第Ⅰ检验水 平的抽样方案;查GB/T2828.11—2008中表B.2,确定抽样公牛的样本量。 5.1.3 复检和仲裁抽样检验 复检可根据原抽样方案确定,仲裁应按照5.1.2规定的方案进行抽样检验,按照7.4.2规定的方案 进行评定。 5.2 抽样方法 随机抽样。 6 试验方法 6.1 外观 用目测法,其结果应符合4.3.1的规定。 2GB/T31582—2015 6.2 剂量 检验按附录A中A.2规定的方法,其结果应符合4.3.2的规定。 6.3 精子分离准确率 检验按A.3规定的方法,其结果应符合4.3.5的规定。 6.4 解冻后精液质量 精子活力、前进运动精子数、精子畸形率及细菌菌落数的检验按照A.4~A.8规定的方法,其结果 应分别符合4.3.3、4.3.4、4.3.6、4.3.7的规定。 7 检验 7.1 检验分类 7.1.1 常规检验 对冷冻精液的单项目检验是型式检验的一部分,主要是在生产批入库前和销出库时的检验。 7.1.2 型式检验 对冷冻精液全部项目检验,评定产品质量是否全面符合标准也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监 督抽样检验时选定项的检验。 7.2 检验项目 7.2.1 常规检验 按照4.3.1和4.3.3的规定。 7.2.2 型式检验 按照4.3.1~4.3.7的规定。 7.3 结果判定 7.3.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到4.3.1和4.3.3的规定要求,则判为不合格。 7.3.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到4.3.1~4.3.7的规定要求,则判为不合格。 7.4 抽样检验对群体质量水平的评定 7.4.1 生产方抽样检验 生产方抽样检验按照GB/T2828.2—2008中第4章的规定,通过对样本检验,若样本中不合格品 数等于或小于接收数Ac,则接收该批(合格),否则不接收该批(不合格)。 3GB/T31582—2015 7.4.2 质量监督抽样检验 按照GB/T2828.11—2008中规定,在样本中d(不合格品数)≤L(不合格品限定数),即抽检样本 符合要求,核查通过;当d>L,即抽检样本不符合要求,核查总体不合格。 8 标识、包装 8.1 标识 8.1.1 品种 种公牛的品种以代号表示,具体遵照GB4143的规定。 8.1.2 内容 应在细管壁和包装袋上印制以下内容,印制标识要清楚,并按以下顺序排列: a) 生产单位代号; b) 公牛品种; c) 公牛注册号; d) 生产日期或批次; e) 分离精子标记:X或Y。 8.2 包装 牛性控冷冻精液细管用塑料管包装,每个包装不得超过25剂。 4GB/T31582—2015 附 录 A (规范性附录) 牛性控冷冻精液质量检验方法 A.1 抽样 A.1.1 样品的收集 抽样:从贮存冷冻精液的液氮容器中按规定随机抽取样品。 送样:将抽取的样品送至质量检测机构。 A.1.2 抽样方案 A.1.2.1 生产方抽样检验 按5.1.1确定样本数。 A.1.2.2 质量监督抽样检验 按5.1.2确定样本数。 A.1.2.3 抽样方法 按牛号顺序排列,由抽样人员现场按样本头数随机确定各样品公牛。 A.1.2.4 全部取样 对已投产的每头公牛取样。 A.1.3 取样方法 确定取样公牛,从贮存冷冻精液的液氮容器中随机抽取大于15剂的性控冷冻精液。 A.1.4 样品的保存 存放性控冷冻精液的液氮容器质量应符合GB/T5458的规定,使用前经过清洗后加入液氮,样品 浸在液氮中。取放样品时在空气中暴露时间不得超过10s。由专人保管样品,样品不允许脱离液氮,抽 样登记单与样品随行。样品包装、标记应保持原样。 A.2 剂量检测 A.2.1 主要器材 小试管、剪刀、刻度吸管。 A.2.2 检测方法 取2剂细管性控冷冻精液自然解冻后剪去超声波封口端,把精液推入一小试管内,用1.0mL刻度 吸管准确吸取精液,并读取总精液量。 5GB/T31582—2015 A.2.3 计算 样品的剂量值为2剂性控冷冻精液总剂量的平均值,按式(A.1)计算: V=n 2……………………(A.1) 式中: V———剂量值,单位为毫升(mL); n———样品总剂量值,单位为毫升(mL)。 A.3 X精子或Y精子分离准确率的检测 A.3.1 机器检测方法 A.3.1.1 主要器材 流式细胞仪或精子纯度检测仪、循环恒温水浴锅、超声波发生器、5mL试管、移液器、0.22μm过滤 器、50μm过滤器。 A.3.1.2 主要试剂及配制方法 主要试剂及配制方法如下: a) 荧光染料Hochest33342(0.05%):将10mg荧光染料Hochest33342定容于20mL双蒸水 中,在5℃条件下避光保存,有效期90d; b) Tris-sheath工作液(pH8.0):取Tris4.776g,柠檬酸2.326g、D-果糖1.710g溶于120mL双 蒸水中搅拌至完全溶解,用4mol/L的NaOH将pH值调到8.0,用双蒸水定容至200mL。 该液用0.22μm的过滤器过滤灭菌后添加国产青霉素2万单位、国产链霉素1万单位,置5℃ 冰箱保存,有效期14d。该液渗透压290mOsm±10mOsm。 注:以上化学试剂纯度均为分析纯。 A.3.1.3 检测方法 在5mL试管里,先加20μL荧光染料Hochest33342(0.05%),再加1mLTris-sheath工作液 (pH8.0)充分混匀,最后将解冻后精液加入管内,精液体积范围30μL~100μL。混匀后放入34℃水 浴锅水浴20min。取出染好的精液,用超声波发生器断去精子尾部后,用50μm过滤器过滤到5mL试 管中。处理好的精液放置避光处。 开启流式细胞仪,作好仪器图像定位。将处理好的精液放入加样器,按照流式细胞仪精子纯度检测 操作流程,检测上述染色样品。重复以上操作3次,取其平均值。 染色后样品应在4h内检测完毕。 3次检测数据误差值大于5%时,应重新操作。 A.3.1.4 计算 X精子的分离准确率按式(A.2)计算: A=A1+A2+A3 3……………………(A.2) 6GB/T31582—2015