ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28106—2011 郁 金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCurtobacterium flaccumfacienspv.oortiiCollins&Jones 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:郭京泽、魏亚东、张裕君、刘跃庭、刘鹏、罗加凤、廖芳、王金成。 ⅠGB/T28106—2011 郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了郁金香黄色疱斑病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于栽培及其他用途的郁金香球茎、郁金香植株上郁金香黄色疱斑病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28—2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 郁金香黄色疱斑病菌基本信息 中文名:郁金香黄色疱斑病菌。 学名:Curtobacteriumflaccumfacienspv.oortii。 异名:Corynebacteriumflaccumfacienspv.oortii(Saaltink&MaasGeesteranus1969)Dye& Kemp1977,Corynebacteriumflaccumfacienssubsp.oortii(Saaltink&MaasGeesteranus1969) Carlson&Vidaver1982,CorynebacteriumoortiiSaaltink&MaasGeesteranus1969。 病害英文名:tulipbacterialcanker,tulipyellowpustule。 属原核生物界Procaryotes,厚壁菌门Firmicutes,厚壁细菌纲Firmibacteria,短小杆菌属Curtobac- terium。 该病菌随带病球茎调运远距离传播。带病球茎通过无性繁育将该病菌传播给子球。植株间通过带 菌病叶扩散传播。 郁金香黄色疱斑病菌其他信息参见附录A。 4 方法原理 从病部样品中分离病菌并纯化,然后通过革兰氏染色、生理生化测定进行该病原细菌的鉴定。郁金 香黄色疱斑病菌的寄主范围、病害症状特征、生物学特性、生理生化特性(参见附录A和附录B)是该病 菌的检疫鉴定依据。 5 仪器、设备 生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、八道移液器,BIOLOG细菌自动鉴定系统。 6 试剂和培养基 无水乙醇、微量发酵管、革兰氏染色液。 1GB/T28106—2011 523培养基:蛋白胨8g,酵母粉4g,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.3g,蔗糖(C12H22O11)10g,磷酸氢 二钾(K2HPO4)2g,琼脂18g,水(H2O)1000mL。调整pH值至7.0~7.1,121℃湿热灭菌20min。 BUG培养基。 7 对照菌株 已知标准菌株作阳性对照菌。选用本属不同种的菌株作为阴性对照菌。 8 检测鉴定 8.1 现场检测 按照SN/T2122的规定进行检疫并抽取样品。 若发现郁金香病株矮化,叶片出现银灰色斑,上下表皮开裂,茎杆内部变黄,球茎最外层鳞片上出现 白色斑,在球茎储藏后期病斑隆起变黄(参见A.3),应取样带回实验室做病菌分离鉴定。 8.2 病原菌分离 取带病样品,用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭表面,晾干或用灭菌水冲洗3次。切取病健交界部位组 织置于灭菌的培养皿中加少量灭菌生理盐水,用玻棒碾碎,用接种环蘸取悬液在523培养基平板上进行 划线分离。每个样品接种不少于3个平板。接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h~72h,检查出 现的菌落情况。 8.3 分离菌的纯化 观察523培养基平板上产生的菌落,有黄色、有光泽、圆形、边缘整齐、直径1mm~1.5mm的菌落 为可疑菌落。 挑取单个可疑菌落,在523培养基平板上划线,接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h~72h。 一般连续转接2次~3次可得到纯化的分离菌。 8.4 革兰氏染色 按GB/T4789.28—2003中2.2规定的方法进行。 8.5 生理生化测定 从郁金香上分离纯化的细菌经过革兰氏染色测定后,若分离菌为革兰氏染色阳性菌,则结合实验条 件任选下列一种方法对分离菌进行生理生化测定: ———应用BIOLOG细菌自动鉴定系统对分离菌进行生理生化测定。按照BIOLOG细菌自动鉴定 系统规定的操作方法进行,鉴定结果为Curtobacteriumflaccumfaciens,则判定该分离菌的 BIOLOG鉴定结果为阳性; ———应用微量发酵管对分离菌进行生理生化测定。测定结果与表B.1结果一致,则生理生化测定 结果为阳性。否则生理生化测定结果为阴性。 9 结果评定 从郁金香上进行细菌分离纯化,若分离菌经过革兰氏染色为阴性菌,则判定检测结果为样品不带郁 金香黄色疱斑病菌。 2GB/T28106—2011 从郁金香上进行细菌分离纯化,分离菌经过革兰氏染色为阳性菌,BIOLOG鉴定结果为阳性,或用 微量发酵管进行生理生化测定其结果为阳性,则判定检验样品带有郁金香黄色疱斑病菌。否则判定检 验样品不带郁金香黄色疱斑病菌。 10 菌株和样品的保存 分离并鉴定为郁金香黄色疱斑病菌的菌株应转接到523培养基试管斜面上,经登记和经手人签字 后置于4℃低温冰箱中保存,定期转接,以防止病菌死亡;必要时冻干后长期保存。 检出郁金香黄色疱斑病菌的样品至少保存6个月;保存期满后,需经灭菌处理。 3GB/T28106—2011 附 录 A (资料性附录) 郁金香黄色疱斑病菌其他信息 A.1 分布 丹麦、荷兰、罗马尼亚、英国、日本、韩国,在我国台湾和杭州有报道。 A.2 寄主范围 郁金香(Tulipgesneriana)。 A.3 危害症状 郁金香黄色疱斑病菌能系统性侵染郁金香,引起郁金香维管束病害,造成郁金香植株叶斑和郁金香 球茎黄色疱斑。感染郁金香黄色疱斑病菌的郁金香病株严重时可出现矮化症状,叶片出现银灰色斑,上 下表皮开裂,茎杆内部变黄,郁金香球茎最外层鳞片上出现白色斑,在球茎储藏后期病斑隆起变黄。在 春季温度低时易于发病。 A.4 生物学特性 菌体杆状,大小(0.4μm~0.6μm)×(0.6μm~3.0μm);周生鞭毛,革兰氏染色阳性,最适生长温 度为25℃~30℃。能水解酪蛋白,能利用乳酸、苹果酸、葡萄糖酸、醋酸盐,不能利用阿拉伯糖、山梨 糖、蔗糖、丙酸、甲酸盐。 4GB/T28106—2011 附 录 B (规范性附录) 郁金香黄色疱斑病菌的生理生化特性 表B.1 郁金香黄色疱斑病菌的生理生化特性 项目Curtobacterium flaccumfaciens pv.oortiiC.albidumC.citreumC.luteumC.plantarumC.pusillumC.flaccumfaciens pv.batae 酪蛋白水解 + + - + - + - 树胶醛糖产酸 - - +W +W d +W - 山梨糖产酸 - - +W - - - - 蔗糖产酸 - - - - - +W - 乳酸同化 + + + - ND + + 苹果酸同化 + - + + d - + 葡萄糖酸同化 + + + + + - + 醋酸盐利用 - + 注:+:90%以上菌株为阳性;-:90%以上菌株为阴性;d:11%~89%菌株为阳性;W:弱反应;ND:未测定。 5GB/T28106—2011