ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T28082—2011 榆 枯萎病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofOphiostomanovo-ulmiBrasier andOphiostomaulmi(Buisman)Nannf. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:吴品珊、严进、杜洪忠。 ⅠGB/T28082—2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了榆枯萎病菌的分离培养、形态学鉴定的方法。 本标准适用于来自榆枯萎病菌有发生国家和地区的榆属(UlmusL.)苗木、原木、木制品和木包装 中榆枯萎病菌的检疫鉴定。 2 榆枯萎病菌基本信息 中文名:榆枯萎病菌。 学名:Ophiostomanovo-ulmiBrasier; Ophiostomaulmi(Buisman)Nannf.。 异名:Ceratocystisulmi(Buism.)Moreau。 病害英文名:dutchelmdisease,elmwiltdisease。 属真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,子囊菌纲Ascomycetes,粪科菌亚纲Sordariomycetidae,长 喙壳目Ophiostomatales,长喙壳科Ophiostomataceae,长喙壳属Ophiostoma。 榆枯萎病菌其他信息参见附录A。 3 方法原理 依据无性孢子和有性世代的形态特征和生物学特性,以及其对寄主造成的症状特征进行检测鉴定。 4 仪器 4.1 生物显微镜。 4.2 体视显微镜。 4.3 光照生物培养箱。 4.4 高压灭菌器。 4.5 超净工作台。 4.6 电子天平。 4.7 摇床。 5 试剂和培养基 5.1 试剂 琼脂粉,麦芽膏,Oxoid麦芽提取物,榆树枝条,葡萄糖,天门冬酰胺(L-asparagine),磷酸二氢钾 (KH2PO4),硫酸镁(MgSO4·7H2O),硫酸锌(ZnSO4),三氯化铁(FeCl3),维生素B1,维生素B6,放线 菌酮,链霉素,青霉素。 注:放线菌酮为剧毒品,注意防护。 1GB/T28082—2011 5.2 培养基 5.2.1 选择性培养基 0.2g放线菌酮溶于100mL水,取50mL加于1000mL麦芽膏(MA)培养基内,灭菌后冷至45℃, 加入10mL含1%链霉素和1%青霉素的混合液。 5.2.2 麦芽膏培养基MA 25g麦芽膏,17g琼脂粉,1000mL蒸馏水,灭菌。 5.2.3 榆边材培养基ESA 取50g健康的榆树边材或枝条,去皮粉碎成直径0.5cm的小块,15g琼脂粉,500mL蒸馏水, 灭菌。 5.2.4 Tchernoff改良培养液 20g葡萄糖、2g天门冬酰胺、1.5g磷酸二氢钾、1g硫酸镁、20mg硫酸锌、10mg三氯化铁、1mg 维生素B1和1mg维生素B6,1000mL蒸馏水,灭菌。 5.2.5 Oxoid麦芽提取物培养基MEA 33gOxoid麦芽提取物,10g琼脂粉,1000mL蒸馏水,灭菌。 6 标准菌株 Ophiostomanovo-ulmiA交配型(Amatingtype),雌性;B交配型(Bmatingtype),雄性。 OphiostomaulmiA交配型(Amatingtype),雌性;B交配型(Bmatingtype),雄性。 中国检验检疫科学院保存病菌的标准菌株。 7 检测 检查苗木、原木或木材的表面,纵向和横向切开树干或枝条检查。 榆枯萎病菌的2个种引起的外观症状是相同的。在树干或枝条的横切面上,可见靠近外面的年轮 附近有深褐色斑点或条纹,有时斑点密集,可连成断续的深褐色圆环。去掉树皮,木质部上有深褐色纵 向条纹,有时条纹不明显,可轻削一层木质,条纹便显现出来。切开枝杈处,常可找到小蠹的蛀食槽。 取有如下症状的样品做病菌分离:干枯呈深褐色的枝条,有小蠹蛀食槽痕迹的树皮,横断面上有深 褐色斑点或断续的褐色圆环枝干,纵切面有褐色条纹枝干,货物上附着有小蠹虫。 8 鉴定 8.1 分离培养 对变色的木质部,去掉树皮,切取直径为5mm大小,于选择性培养基(见5.2.1)上,20℃黑暗培 养;对有虫蛀槽的树皮,清除蛀槽内的虫粪和残屑,70%酒精消毒10s~30s,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干 水分,切取边长为5mm~10mm的大小,于选择性培养基上,20℃黑暗培养;小蠹虫解肢为5mm大 小,70%酒精消毒10s~30s,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,于选择性培养基上,20℃黑暗培养。一 2GB/T28082—2011 旦有真菌菌落出现,立即分别转皿。 转皿到ESA培养基,20℃培养,以期获得粘束梗霉Pesotumulmi;转接于Tchernoff改良培养液 中,室温下110r/min振荡培养,以期获得酵母状分生孢子Blastomyces;转皿到MEA培养基,20℃黑 暗培养,以做种的鉴定。 8.2 子囊孢子培育 子囊孢子需在A、B型2种交配型同时存在的ESA培养基上形成。如确认在ESA培养基上长出 褐色粘束梗霉,同时取Ophiostomanovo-ulmi(任意亚种)和Ophiostomaulmi标准菌株的A、B交配 型,分别与分离出的病菌,等距离三角形接种在ESA培养基上,各重复3皿,20℃黑暗培养7d,然后室 温(20℃~25℃)漫射光下继续培养14d。 8.3 种的鉴定 菌落形态、菌落生长速度和最佳生长温度,是区分榆枯萎病菌两个种的主要指标。 取在MEA培养基上培养的新鲜菌块(2mm大小),转接在MEA培养基中央,共转6皿,3皿置于 20℃黑暗培养,3皿置于33℃黑暗培养。 20℃黑暗培养2d后,取出培养皿测量菌落直径D0,继续在20℃黑暗培养5d,再次测量菌落直径 D1,按(D1-D0)/5计算病菌5d的平均辐射状生长速度(mm/d)。最后将培养皿置于室温,漫射光继 续培养10d,以观察菌落特征。 33℃黑暗培养2d后,取出培养皿测量菌落直径E0,继续在33℃黑暗培养8d,再次测量菌落直径 E1,按(E1-E0)/8计算待测菌8d的平均辐射状生长速度(mm/d)。最后将培养皿置于室温,漫射光继 续培养10d,以观察菌落特征。 必要时做亚种鉴定(参见附录B)。 9 结果判定 9.1 Ophiostomanovo-ulmi 9.1.1 菌落特征 在MEA培养基上,经20℃黑暗7d和室温漫射光10d培养后,菌落灰白至乳白色,花瓣状、轮纹明 显。气生菌丝量中等,常结集成绳索状使菌落有条纹呈现。欧亚亚种O.novo-ulmisubsp.novo-ulmi 的菌落条纹较少,边缘有不规则的叶状浅裂。 O.novo-ulmi在20℃黑暗条件下生长较快。生长速度为(2.8mm/d~)3.1mm/d~4.8mm/d(~ 5.7mm/d),33℃的生长速度为(0mm/d~)0.1mm/d~0.5mm/d。 9.1.2 病菌形态 菌丝:分隔,直径1μm~6μm,气生菌丝常结集成绳索状,菌丝体分生孢子丰富。 粘束梗霉Pesotumulmi:易在ESA培养基上形成。束丝无性态(synnematalanamorph)单个或多 个,褐色到黑色,纤细,1mm~2mm长;褐色假根状菌丝附着在培养基上,褐色有隔菌丝平行构成束状, 顶部张开分枝成透明的菌丝,其上产生分生孢子。分生孢子全壁芽殖、单胞、透明、卵形到椭圆形、大小 为(2μm~6μm)×(1μm~3μm),聚集成乳白色粘性孢子滴(参见附录C)。 发簇孢Sporothrix:可在大多数培养基上形成。分生孢子梗多侧生,10μm~30μm(~50μm),分 生孢子(4.5μm~14μm)×(2μm~3μm),全壁芽生,有0.5μm~1μm的细齿,单胞、透明,椭圆形至长 形,尖端通常较细、微弯,连有一个小囊领。菌丝体分生孢子常聚成粘性滴状,酵母状芽殖。 3GB/T28082—2011 酵母状分生孢子Blastomyces:在液体培养基中产生,单胞,酵母状芽殖,孢子大小变化很大。 子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生,有褐色假根状菌丝附着在基质上。子囊壳基部球形、黑 色,宽75μm~140μm,刚毛稀少至中度,褐色至黑色、有隔130μm×3μm;子囊壳颈部黑色,长 230μm~640μm(~1070μm),颈基部直径19μm~36μm,顶部9μm~14μm;颈长度与基部球宽度之 比通常为1.5~6.2;孔口缘丝茂盛,透明、有隔、少分枝,(20μm~60μm)×(1μm~2μm);子囊薄壁、 球形至卵形、易消解;子囊孢子透明、单胞、桔瓣形,(4.5μm~6μm)×(1μm~1.5μm),聚生成奶白色 粘性孢子滴。自然条件下产生的交配型B占优势,雌性交配型A强烈排斥O.ulmi的雄性交配型B。 9.2 Ophiostomaulmi 9.2.1 菌落特征 在MEA培养基上经20℃黑暗7d和室温漫射光10d培养后,菌落呈光滑蜡质、苔状,轮纹不明显。 乳白至黄褐色,偶有紫褐色斑块,气生菌丝难辨。 在20℃时,生长速度为(1.5mm/d~)2.0mm/d~3.1mm/d(~3.5mm/d),在33℃条件下的生 长速度较O.novo-ulmi快,为1.1mm/d~2.8mm/d。 9.2.2 病菌形态 O.ulmi的3种分生孢子的形态与O.novo-ulmi基本一致(9