ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T17818—2025 代替GB/T17818—2010 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法 DeterminationofvitaminD3infeeds—High-performanceliquidchromatography 2025-01-24发布 2025-08-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T17818—2010《饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法》。与GB/T17818— 2010相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了适用范围,增加了精料补充料,更改了“第一法 皂化提取法”定量限(见第1章,2010 年版的第1章); b) 更改了“第二法 直接提取法”定量限(见第1章,2010年版的第1章); c) 增加了“第一法 皂化提取法”维生素D3标准系列溶液(见4.2.21); d) 更改了“第一法 皂化提取法”中配合饲料、精料补充料、浓缩饲料样品制备方法为试样全部通 过1mm孔筛(见4.4,2010年版的3.5); e) 更改了“第一法 皂化提取法”提取剂为“石油醚”(沸程30℃~60℃)(见4.5.1.2.1,2010年版 的3.6.1.2); f) 增加了离线固相萃取法(见4.5.1.2.2)和在线固相萃取法(见4.5.1.2.3); g) 增加了液相色谱参考条件(见4.5.2.2,4.5.2.3); h) 增加了定性检测方法,定量检测增加多点校正(见4.5.2.5,4.5.2.6); i) 删除了高效液相色谱净化柱净化(见2010年版的3.6.1.4); j) 删除了高效液相色谱净化条件(见2010年版的3.6.2.1); k) 删除了正相色谱(见2010年版的3.6.2.2.1); l) 增加维生素D3含量在100IU/kg~1000IU/kg范围时精密度要求(见4.7,2010年版的 3.6.2.5); m) 更改了“第二法 直接提取法”,水浴温度不应超过65℃(见5.5.1,2010年版的4.6.1); n) 增加了定性检测方法(见5.5.2.3)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,山东省畜产品质量安全中 心,帝斯曼维生素(上海)有限公司,四川威尔检测技术股份有限公司,中牧实业股份有限公司,广州爱保 农生物科技有限公司。 本文件主要起草人:赵小阳、虞哲高、宋荣、张凤枰、朱高群、刘志英、汪忠艳、郭红双、马晓忠、张玮、 谢丽、宋艳、张辉、李丽蓓、陈学海、陈雪、崔婕、冯秀燕、曹林。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———1999年首次发布为GB/T17818—1999,2010年第一次修订; ———本次为第二次修订。 ⅠGB/T17818—2025 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件描述了饲料中维生素D3的高效液相色谱测定方法。 本文件中“第一法 皂化提取法”适用于配合饲料、精料补充料、浓缩饲料、复合预混合饲料中维生 素D3的测定,“第二法 直接提取法”适用于维生素预混合饲料中维生素D3的测定。 本文件第一法定量限为100IU/kg,第二法定量限为2.00×105IU/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 第一法 皂化提取法 注意:分液漏斗活塞玻璃表面不涂油,处理过程在避光下操作;提取过程在通风柜中操作。 4.1 原理 试样用氢氧化钾乙醇溶液皂化,经液液萃取或固相萃取净化、浓缩后,用二维色谱系统分离,紫外检 测器检测,外标法定量。复合预混合饲料也可直接用反相色谱柱分离,紫外检测器检测,外标法定量。 4.2 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 4.2.1 水:GB/T6682,一级。 4.2.2 无水乙醇:色谱纯。 4.2.3 无水乙醇。 4.2.4 石油醚(沸程30℃~60℃)。 4.2.5 甲醇:色谱纯。 4.2.6 乙腈:色谱纯。 4.2.7 甲酸:色谱纯。 4.2.8 异丙醇:色谱纯。 1GB/T17818—2025 4.2.9 L-抗坏血酸。 4.2.10 二丁基羟基甲苯(BHT)。 4.2.11 无水硫酸钠。 4.2.12 氢氧化钾溶液(500g/L):称取500g氢氧化钾,加水溶解,冷却后用水定容至1L,混匀。 4.2.13 乙醇溶液Ⅰ(70%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)700mL,用水稀释,定容至1L,混匀。 4.2.14 乙醇溶液Ⅱ(50%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)500mL,用水稀释,定容至1L,混匀。 4.2.15 甲醇溶液(10%,体积分数):量取甲醇10mL,用水稀释,定容至100mL,混匀。 4.2.16 甲酸溶液(0.1%,体积分数):量取甲酸1mL,用水稀释,定容至1L,混匀。 4.2.17 乙醇溶液Ⅲ(40%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)400mL,用水稀释,定容至1L,混匀。 4.2.18 乙腈-异丙醇混合溶液:量取50mL乙腈(4.2.6)与50mL异丙醇(4.2.8)混合均匀。 4.2.19 维生素D3标准储备液(40000IU/mL):称取50mg维生素D3(胆钙化醇)标准品(C27H44O, CAS号:67-97-0,纯度≥99.0%,或标准物质/标准样品)(精确至0.00001g)于50mL棕色容量瓶中,用 无水乙醇(4.2.2)溶解并稀释至刻度,混匀,-20℃~-18℃避光保存,有效期为6个月。 注:1国际单位(IU)维生素D3相当于0.025μg胆钙化醇。 4.2.20 维生素D3标准中间溶液(1000IU/mL):准确移取维生素D3标准储备液(4.2.19)0.25mL于 10mL棕色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)稀释定容,混匀,临用现配。 4.2.21 维生素D3标准系列溶液Ⅰ:准确吸取适量的维生素D3标准中间溶液(4.2.20),于100mL棕 色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)稀释并定容,混匀,配制成质量浓度分别为0.05IU/mL、0.1IU/mL、 0.2IU/mL、0.5IU/mL、1.0IU/mL、5.0IU/mL、10.0IU/mL、20.0IU/mL及5.0IU/mL、 10.0IU/mL、20.0IU/mL、50.0IU/mL、100.0IU/mL标准系列溶液,临用现配。 4.2.22 维生素D3标准系列溶液Ⅱ:准确吸取适量的维生素D3标准中间溶液(4.2.20),于100mL棕 色容量瓶中,用乙醇溶液Ⅱ(4.2.14)稀释并定容,混匀,配制成质量浓度分别为0.06IU/mL、 0.12IU/mL、0.24IU/mL、0.4IU/mL、0.80IU/mL、1.6IU/mL、4.0IU/mL、8.0IU/mL、16IU/mL标 准系列溶液,临用现配。 4.2.23 酚酞指示剂(10g/L):称取1g酚酞,用95%乙醇溶解,并稀释至100mL,混匀。 4.2.24 固相萃取柱:填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物,200mg/6mL,或相当者。 4.2.25 在线固相萃取柱:填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物,长为12.5mm,内径为4.6mm,粒径为 15μm~20μm,或相当者。 4.2.26 微孔滤膜:孔径0.2μm,有机系。 4.2.27 氮气:纯度99.9%。 4.3 仪器和设备 4.3.1 高效液相色谱仪:配有紫外吸收检测器(或二极管矩阵检测器)。 4.3.2 二维液相色谱系统:配有1个紫外检测器(或二极管矩阵检测器)和1个高灵敏度紫外检测器(或 二极管矩阵检测器)。 4.3.3 在线固相萃取-二维液相色谱系统:在二维液相色谱的系统上增加1个泵和1个六通阀。 4.3.4 分析天平:精度为0.01g、0.001g、0.0001g和0.00001g。 4.3.5 回流装置:圆底烧瓶和冷凝管。 4.3.6 恒温水浴锅:控温精度±2℃。 4.3.7 旋转蒸发仪。 4.3.8 离心机:转速不低于10000r/min。 4.3.9 固相萃取装置。 4.3.10 氮吹仪:带加热装置,控温精度±2℃。 2GB/T17818—2025 4.3.11 涡旋混合器。 4.4 样品 配合饲料、精料补充料、浓缩饲料试样,按照GB/T20195规定制备试样,至少200g,粉碎使其全部 通过1mm孔径的试验筛,混合均匀,装入密闭容器中,2℃~8℃避光保存,尽快测定。复合预混合饲 料试样经缩分、混合均匀后装入密闭容器中,2℃~8℃避光保存,尽快测定。 4.5 试验步骤 4.5.1 试样溶液的制备 4.5.1.1 皂化 平行做两份试验。称取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料5g~10g(精确至0.01g);称取复合预混 合饲料4g(精确至0.001g),置入250mL圆底烧瓶中,加1gL-抗坏血酸(4.2.9)、0.2gBHT (4.2.10),加入50mL无水乙醇(4.2