书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７８１２ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７８１２ — １９９９ 饲料中维生素 犈 的测定 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狏犻狋犪犿犻狀犈犻狀犳犲犲犱狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２００８  １２  ３１ 发布 ２００９  ０５  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１７８１２ — １９９９ 《 饲料中维生素 Ｅ 的测定 　 高效液相色谱法 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１７８１２ — １９９９ 相比主要变化如下 ： ——— 原标准方法为第一法皂化提取法 （ 仲裁法 ）； ——— 补充第二法直接提取法 （ 快速法 ）， 适用于维生素预混料中维生素 Ｅ 的测定 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 、 国家饲料质量监督检验中心 （ 北京 ）， 北京桑普生物化学技术有限公司 ， 广东爱保农科技有限公司 ， 帝斯曼维生素 （ 上海 ） 有限公司 。 本标准主要起草人 ： 赵小阳 、 施文娟 、 虞哲高 、 吴革华 、 李俊玲 、 李永才 、 张进 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１７８１２ — １９９９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７８１２ — ２００８ 饲料中维生素 犈 的测定 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了饲料中维生素 Ｅ 的测定 ——— 高效液相色谱法 。 本标准第一法适用于配合饲料 、 浓缩饲料 、 复合预混合饲料 、 维生素预混合饲料中维生素 Ｅ （ 犱犾  α  生 育酚 ） 的测定 ， 定量限为 １ｍｇ ／ ｋｇ 。 本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素 Ｅ （ 犱犾  α  生育酚乙酸酯 ） 的测定 ， 定量限为 ２０ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 　 化学试剂 　 试验方法中所用制剂及制品的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ６０３ — ２００２ ， ＩＳＯ６３５３１ ： １９８２ ， ＮＥＱ ） ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 （ ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ — ２００５ ， ＩＳＯ６４９７ ： ２００２ ， ＩＤＴ ） ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ — ２００６ ， ＩＳＯ６４９８ ： １９９８ ， ＩＤＴ ） ３ 　 第一法 　 皂化提取法 （ 仲裁法 ） ３ ． １ 　 原理 用碱溶液皂化试验样品 ， 使试样中天然生育酚释放出来 ， 添加的 犱犾  α  生育酚乙酸酯转化为游离的 犱犾  α  生育酚 ， 乙醚提取 ， 蒸发乙醚 ， 用正己烷溶解残渣 。 试液注入高效液相色谱柱 ， 用紫外检测器在 ２８０ｎｍ 处测定 ， 外标法计算维生素 Ｅ （ 犱犾  α  生育酚 ） 含量 。 ３ ． ２ 　 试剂和溶液 除特殊注明外 ， 本标准所用试剂均为分析纯 ， 水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中三级用水规定 ， 色谱用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级用水规定 ， 溶液按照 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 配制 。 ３ ． ２ ． １ 　 碘化钾溶液 ： １００ｇ ／ Ｌ 。 ３ ． ２ ． ２ 　 淀粉指示液 ： ５ｇ ／ Ｌ 。 ３ ． ２ ． ３ 　 硫代硫酸钠溶液 ： ５０ｇ ／ Ｌ 。 ３ ． ２ ． ４ 　 无水乙醚 ： 不含过氧化物 。 ３ ． ２ ． ４ ． １ 　 过氧化物检查方法 ： 用 ５ｍＬ 乙醚加 １ｍＬ 碘化钾溶液 （ ３．２．１ ）， 振摇 １ｍｉｎ ， 如有过氧化物则 放出游离碘 ， 水层呈黄色 ， 或加淀粉指示液 （ ３．２．２ ）， 水层呈蓝色 。 该乙醚需处理后使用 。 ３ ． ２ ． ４ ． ２ 　 去除过氧化物的方法 ： 乙醚用硫代硫酸钠溶液 （ ３．２．３ ） 振摇 ， 静置 ， 分取乙醚层 ， 再用蒸馏水振 摇 ， 洗涤两次 ， 重蒸 ， 弃去首尾 ５％ 部分 ， 收集馏出的乙醚 ， 再检查过氧化物 ， 应符合规定 。 ３ ． ２ ． ５ 　 无水乙醇 。 ３ ． ２ ． ６ 　 正己烷 ： 色谱纯 。 １ 犌犅 ／ 犜 １７８１２ — ２００８ ３ ． ２ ． ７ 　 １ ， ４ 二氧六环 。 ３ ． ２ ． ８ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ３ ． ２ ． ９ 　 ２ ， ６ 二叔丁基对甲酚 （ ＢＨＴ ）。 ３ ． ２ ． １０ 　 无水硫酸钠 。 ３ ． ２ ． １１ 　 氢氧化钾溶液 ： ５００ｇ ／ Ｌ 。 ３ ． ２ ． １２ 　 Ｌ 抗坏血酸乙醇溶液 ： ５ｇ ／ Ｌ 。 取 ０．５ｇＬ 抗坏血酸结晶纯品溶解于 ４ｍＬ 温热的蒸馏水中 ， 用 无水乙醇 （ ３．２．５ ） 稀释至 １００ｍＬ ， 临用前配制 。 ３ ． ２ ． １３ 　 维生素 Ｅ （ 犱犾  α  生育酚 ） 对照品 ： 犱犾  α  生育酚含量 ≥ ９９．０％ 。 ３ ． ２ ． １４ 　 犱犾  α  生育酚标准贮备液 ： 称取 犱犾  α  生育酚对照品 （ ３．２．１３ ） １００ｍｇ （ 精确至 ０．００００１ｇ ） 于 １００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用正己烷溶解并稀释至刻度 ， 混匀 ， ４℃ 保存 。 该贮备液浓度为 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 。 ３ ． ２ ． １５ 　 犱犾  α  生育酚标准工作液 ： 准确吸取 犱犾  α  生育酚标准贮备液 （ ３．２．１４ ）， 用正己烷 （ ３．２．６ ） 按 １∶２０ 比例稀释 。 若用反相色谱测定 ， 将 １．０ｍＬ 犱犾  α  生育酚标准贮备液置入 １０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用 氮气吹干 ， 用甲醇 （ ３．２．８ ） 稀释至刻度 ， 混匀 ， 再按比例稀释 ， 配制工作液浓度为 ５０ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ３ ． ２ ． １６ 　 酚酞指示剂乙醇溶液 ： １０ｇ ／ Ｌ 。 ３ ． ２ ． １７ 　 氮气 （ 纯度 ９９．９％ ）。 ３ ． ３ 　 仪器和设备 ３ ． ３ ． １ 　 分析天平 ， 感量分别为 ０．０００１ｇ 、 ０．００００１ｇ 。 ３ ． ３ ． ２ 　 圆底烧瓶 ， 带回流冷凝器 。 ３ ． ３ ． ３ 　 恒温水浴或电热套 。 ３ ． ３ ． ４ 　 旋转蒸发器 。 ３ ． ３ ． ５ 　 超纯水器 。 ３ ． ３ ． ６ 　 高效液相色谱仪 ， 带紫外可调波长检测器 （ 或二极管矩阵检测器 ）。 ３ ． ４ 　 采样 按照 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 的规定执行 。 ３ ． ５ 　 试样制备 按照 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 制备试样 ， 磨碎 ， 全部通过 ０．２８ｍｍ 孔筛 ， 混匀 ， 装入密闭容器中 ， 避光低温保存 备用 。 ３ ． ６ 　 分析步骤 警告 ——— 在通风柜内操作 ！ ３ ． ６ ． １ 　 试样溶液的制备 ３ ． ６ ． １ ． １ 　 皂化 称取试样配合饲料或浓缩饲料 １０ｇ ， 精确至 ０．００１ｇ ， 维生素预混料或复合预混料 １ｇ ～ ５ｇ ， 精确至 ０．０００１ｇ ， 置入 ２５０ｍＬ 圆底烧瓶中 ， 加 ５０ｍＬＬ 抗坏血酸乙醇溶液 （ ３．２．１２ ）， 使试样完全分散 、 浸湿 ， 置于水浴上加热直到沸点 ， 用氮气吹洗稍冷却 ， 加 １０ｍＬ 氢氧化钾溶液 （ ３．２．１１ ）， 混合均匀 ， 在氮气流 下沸腾皂化回流 ３０ｍｉｎ ， 不时振荡防止试样粘附在瓶壁上 ， 皂化结束 ， 分别用 ５ｍＬ 无水乙醇 （ ３．２．５ ）、 ５ｍＬ 水自冷凝管顶端冲洗其内部 ， 取出烧瓶冷却至约 ４０℃ 。 ３ ． ６ ． １ ． ２ 　 提取 定量的转移全部皂化液于盛有 １００ｍＬ 无水乙醚 （ ３．２．４ ） 的 ５００ｍＬ 分液漏斗中 ， 用 ３０ｍＬ ～ ５０ｍＬ 蒸馏水分 ２ 次 ～ ３ 次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗 ， 加盖 、 放气 ， 随后混合 ， 激烈振荡 ２ｍｉｎ ， 静置 、 分层 。 转移水相于第二个分液漏斗中 ， 分次用 １００ｍＬ 、 ６０ｍＬ 乙醚重复提取两次 ， 弃去水相 ， 合并三次乙醚相 。 用蒸馏水每次 １００ｍＬ 洗涤乙醚提取液至中性 ， 初次水洗时轻轻旋摇 ， 防止乳化 。 乙醚提取液通过无水 ２ 犌犅 ／ 犜 １７８１２ — ２００８ 硫酸钠 （ ３．２．１０ ） 脱水 ， 转移到 ２５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 加 １００ｍｇＢＨＴ （ ３．２．９ ） 使之溶解 ， 用乙醚定容至 刻度 （ 犞 １ ）。 ３ ． ６ ． １ ． ３ 　 浓缩 从乙醚提取液 （ 犞 １ ） 中分取一定体积 （ 犞 ２ ）（ 依据样品标示量 、 称样量和提取液量确定分取量 ） 置于