书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １７４８０ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１７４８０ — １９９８ 饲料中黄曲霉毒素 犅 １ 的测定 酶联免疫吸附法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犳犾犪狋狅狓犻狀犅 １ 犻狀犪狀犻犿犪犾犳犲犲犱犻狀犵狊狋狌犳犳狊 — 犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔 ２００８  １１  ２１ 发布 ２００９  ０２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ１７４８０ — １９９８ 《 饲料中黄曲霉毒素 Ｂ １ 的测定 　 酶联免疫吸附法 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ１７４８０ — １９９８ 相比主要修改如下 ： ——— 范围中增加 “ 本标准检出限为 ０．１ μ ｇ ／ ｋｇ ”； ——— 规范性引用文件中 ， 用 “ ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 动物饲料 　 试样的制备 ” 代替 “ ＧＢ ／ Ｔ８３８１ — １９８７ 饲料中 黄曲霉毒素 Ｂ １ 的测定方法 ”； ——— 试剂盒组成中 ， 增加 “ 注意 ： 不同测试盒制造商间的产品组成和操作会有细微的差别 ， 应严格按 说明书要求规范操作 ”； ——— 仪器 、 设备条款中 ， 删除冰箱条款 ； 增加电动振荡器 、 具塞磨三角瓶 ； ——— 将 “ 取样 ” 条款改为 “ 试样制备 ”， 同时将 “ 按 ＧＢ ／ Ｔ８３８１ — １９８７ 中 ５．１ 要求采集 、 处理样品 ， 制 成分析用的试样 ” 改为 “ 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 要求制备试样 ”； ——— 限量测定条款中 ， 将测定操作的分级条款合并为一个条款 ， 并删除表格 ， 均用文字叙述测定 过程 ； ——— 定量测定条款中增加 “ 结果保留 ２ 位有效数字 ”； ——— 原 “ 其他 ” 条款删除 ， 将 “ 凡接触 ＡＦＢ １ 的容器 ， 需浸入 １％ 次氯酸钠 （ ＮａＣｌＯ ２ ） 溶液 ， １２ｈ 后清洗 备用 。 为分析人员安全 ， 操作时要带上医用乳胶手套 ” 改为 “ 警告 ” 条款 ； ——— 增加了资料性附录 Ａ ； ——— 将样品溶液稀释表及稀释倍数与结果计算表作为资料性附录 Ｂ 。 本标准的附录 Ａ 和附录 Ｂ 均为资料性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 江苏省微生物研究所有限责任公司 。 本标准主要起草人 ： 李利东 、 宓晓黎 、 袁建兴 、 杜姝莲 。 本标准于 １９９８ 年首次发布 ， 本次为第一次修订 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １７４８０ — ２００８ 饲料中黄曲霉毒素 犅 １ 的测定 酶联免疫吸附法 １ 　 范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素 Ｂ １ 的酶联免疫吸附测定 （ ＥＬＩＳＡ ） 方法 。 本标准适用于各种饲料原料 、 配合饲料及浓缩饲料中黄曲霉毒素 Ｂ １ 的测定 。 本标准检出限为 ０．１ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ — ２００６ ， ＩＳＯ６４９８ ： １９９８ ， ＩＤＴ ） ３ 　 原理 试样中黄曲霉毒素 Ｂ １ 、 酶标黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗原与包被于微量反应板中的黄曲霉毒素 Ｂ １ 特异性抗 体进行免疫竞争性反应 ， 加入酶底物后显色 ， 试样中黄曲霉毒素 Ｂ １ 的含量与颜色成反比 。 用目测法或 仪器法通过与黄曲霉毒素 Ｂ １ 标准溶液比较判断或计算试样中黄曲霉毒素 Ｂ １ 的含量 。 ４ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ４ ． １ 　 黄曲霉毒素 Ｂ １ 酶联免疫测试盒中的试剂 注意 ： 不同测试盒制造商间的产品组成和操作会有细微的差别 ， 应严格按说明书要求规范操作 。 ４ ． １ ． １ 　 包被抗黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗体的聚苯乙烯微量反应板 。 ４ ． １ ． ２ 　 样品稀释液 ： 甲醇  蒸馏水 （ ７＋９３ ）。 ４ ． １ ． ３ 　 黄曲霉毒素 Ｂ １ 标准溶液 ： １．００ μ ｇ ／ Ｌ 、 ５０．００ μ ｇ ／ Ｌ 。 警告 ——— 凡接触黄曲霉毒素 犅 １ 的容器 ， 需浸入 １ ％ 次氯酸钠 （ 犖犪犆犾犗 ２ ） 溶液 ， １２ 犺 后清洗备用 。 为 分析人员安全 ， 操作时要带上医用乳胶手套 。 ４ ． １ ． ４ 　 酶标黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗原 ： 黄曲霉毒素 Ｂ １  辣根过氧化物酶交联物 。 ４ ． １ ． ５ 　 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ７．５ 磷酸盐缓冲液的配制 ： 称取 ３．０１ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ）、 ０．２５ｇ 磷酸二氢钠 （ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ）、 ８．７６ｇ 氯化钠 （ ＮａＣｌ ）， 加水溶解至 １Ｌ 。 ４ ． １ ． ６ 　 酶标黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗原稀释液 ： 称取 ０．１ｇ 牛血清白蛋白 （ ＢＳＡ ） 溶于 １００ｍＬｐＨ７．５ 磷酸盐缓 冲液 （ ４．１．５ ）。 ４ ． １ ． ７ 　 ０．１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ７．５ 磷酸盐缓冲液 ： 称取 ３０．１ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ）、 ２．５ｇ 磷酸二 氢钠 （ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ）、 ８７．６ｇ 氯化钠 （ ＮａＣｌ ）， 加水溶解至 １Ｌ 。 ４ ． １ ． ８ 　 洗涤母液 ： 吸取 ０．５ｍＬ 吐温 ２０ 于 １０００ｍＬ０．１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ７．５ 磷酸盐缓冲液 （ ４．１．７ ）。 ４ ． １ ． ９ 　 ｐＨ５．０ 乙酸钠  柠檬酸缓冲液 ： 称取 １５．０９ｇ 乙酸钠 （ ＣＨ ３ ＣＯＯＮａ · ３Ｈ ２ Ｏ ）、 １．５６ｇ 柠檬酸 （ Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ · Ｈ ２ Ｏ ）， 加水溶解至 １Ｌ 。 ４ ． １ ． １０ 　 底物溶液 ａ ： 称取四甲基联苯胺 （ ＴＭＢ ） ０．２ｇ 溶于 １ＬｐＨ５．０ 乙酸钠  柠檬酸缓冲液 。 １ 犌犅 ／ 犜 １７４８０ — ２００８ ４ ． １ ． １１ 　 底物溶液 ｂ ： １ＬｐＨ５．０ 乙酸钠  柠檬酸缓冲液中加入 ０．３％ 过氧化氢溶液 ２８ｍＬ 。 ４ ． １ ． １２ 　 终止液 ： 硫酸溶液 ， 犮 （ Ｈ ２ ＳＯ ４ ） ＝２ｍｏｌ ／ Ｌ 。 ４ ． ２ 　 甲醇水溶液 ： ５ｍＬ 甲醇加 ５ｍＬ 水混合 。 ４ ． ３ 　 测试盒中试剂的配制 ４ ． ３ ． １ 　 酶标黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗原溶液 ： 在酶标黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗原 （ ４．１．４ ） 中加入 １．５ｍＬ 酶标黄曲霉 毒素 Ｂ １ 抗原稀释液 （ ４．１．６ ）， 配成试验用酶标黄曲霉毒素 Ｂ １ 抗原溶液 ， 冰箱中保存 。 ４ ． ３ ． ２ 　 洗涤液 ： 洗涤母液 （ ４．１．８ ） 中加 ３００ｍＬ 蒸馏水配成试验用洗涤液 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 小型粉碎机 。 ５ ． ２ 　 分样筛 ： 孔径 １．００ｍｍ 。 ５ ． ３ 　 分析天平 ： 感量 ０．０１ｇ 。 ５ ． ４ 　 滤纸 ： 快速定性滤纸 ， 直径 ９ｃｍ ～ １０ｃｍ 。 ５ ． ５ 　 具塞三角瓶 ： １００ｍＬ 。 ５ ． ６ 　 电动振荡器 。 ５ ． ７ 　 微量连续可调取液器及配套吸头 ： １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ 。 ５ ． ８ 　 恒温培养箱 。 ５ ． ９ 　 酶标测定仪 ： 内置 ４５０ｎｍ 滤光片 。 ６ 　 分析步骤 ６ ． １ 　 试样制备 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 要求制备试样 。 试样需通过孔径 １．００ｍｍ 的分样筛 。 如果样品脂肪含量超过 １０％ ， 在粉碎之前用石油醚脱脂 。 在这种情况下 ， 分析结果以未脱脂样品 质量计 。 ６ ． ２ 　 试样提取 ６ ． ２ ． １ 　 称取 ５ｇ 试样 （ ６．１ ）， 精确至 ０．０１ｇ ， 置于 １００ｍＬ 具塞三角瓶 （ ５．５ ） 中 ， 加入甲醇水溶液 （ ４．２ ） ２５ｍＬ ， 加塞振荡 １０ｍｉｎ ， 过滤 ， 弃去 １ ／ ４ 初滤液 ， 再收集适量试样液 。 如果样品中离子浓度高 ， 建议按 照附录 Ａ 的规定对试样滤液进行萃取 。 ６ ． ２ ． ２ 　 根据各种饲料中黄曲霉毒素 Ｂ １ 的限量规定和黄曲霉毒素 Ｂ １ 标准溶液 （ ４．１．３ ） 浓度 ， 用样品稀 释液 （ ４．１．２ ） 将试样液 （ ６．２．１ ） 适当稀释 ， 制成待测试样稀释液 。 如果黄曲霉毒素 Ｂ １ 标准溶液浓度为 １．００ μ ｇ ／ Ｌ 时 ， 建议按照附录 Ｂ 的规定稀释试样 。 ６ ． ３ 　 限量测定 ６ ． ３ ． １ 　 试剂平衡 ： 将测试盒 （ ４．１ ） 于室温中放置约 １５ｍｉｎ ， 平衡至室温 。 ６ ． ３ ． ２ 　 测定 ： 在微量反应板 （ ４．１．１ ） 上选一孔 ， 加入 ５０ μ Ｌ 样品稀释液 （ ４．１．２ ）、 ５０ μ