(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210021425.5 (22)申请日 2022.01.10 (66)本国优先权数据 202210007351.X 202 2.01.06 CN (71)申请人 福建师范大学 地址 350117 福建省福州市仓山区上三路8 号 申请人 福建省水产技 术推广总站 （福建省 水生动物疫病预防控制中心） (72)发明人 陈骐　李成龙　林楠　王巧煌　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 彭琴　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G01N 33/543(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) (54)发明名称 基于CRISPR/Cas12a的对虾急性肝胰腺坏死 病快速检测试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a的对 虾急性肝胰腺坏死病快速检测试剂盒及检测方 法。 该试剂盒包括用于对虾急性肝胰腺坏死病快 速检测的RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体 系。 该方法将RPA技术与CRISPR/Cas12a系统联合 使用开发RPA ‑CRISPR/Cas12a新型分子诊断方 式， 通过37 °C恒温扩增目的片段， 针对引起水产 鱼虾AHPND病的 PirVPA和PirVPB基因设计检测位 点， 将检测结果通过试纸条的方式呈现。 该方法 通过简单的实验器材和操作实现在基层快速、 有 效的对感染病虾进行检测， 实现有病无病水产的 快速区分， 减少水产养殖业的损失。 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图4页 CN 114350759 A 2022.04.15 CN 114350759 A 1.一种基于CRISPR/Cas12a的对虾 急性肝胰腺坏死病快速检测试剂盒， 其特征在于： 所 述试剂盒包括用于对虾急性肝胰腺坏死病快速检测的RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测 体系； 所述RPA扩增体系包括： 针对对虾急性肝胰腺坏死病 PirVPA和PirVPB基因的体外恒 温扩 增特异性RPA引物； 所述针对对虾急性肝胰腺坏死病 PirVPA和PirVPB基因的特异性RPA引物 为PirAB‑RPA‑F3/R3， 核苷酸序列如下： PirAB‑RPA‑F3： 5’ ‑TGCATAAGCTAACACGTAATATTGATAAGC‑3’； PirAB‑RPA‑R3： 5’ ‑GCAGGTGAATATGAAATTAAATTACTGTGA A‑3’； 所述CRISP R/Cas12a检测体系包括： 针对对虾急性肝胰腺坏死病 PirVPA和PirVPB基因的 特异性crRNA、 Cas12a 蛋白和单链DNA报告系统； 所述针对对虾急性肝胰腺坏死病 PirVPA和PirVPB基因的特异性crRNA为PirAB ‑crRNA3， 其核苷酸序列如下： PirAB‑crRNA3： 5 ’ ‑UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUA ACAUAUGCU UAUUUGGCAA‑3’； 所述单链DNA报告系统包括用于荧光检测的荧光探针FAM ‑TTATT‑TAMRA， 或用于免疫胶 体金试纸条检测的荧 光探针FAM ‑TTATT‑Biotin。 2.一种基于CRISPR/Cas12a的对虾 急性肝胰腺坏死病快速检测方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： （1） 提取待测样品DNA； （2） 利用体外恒温扩增特异性RPA引物扩增待测样品中的目的片段： 以步骤 （1） 提取的 核酸为模板， 将特异性RPA引物加 入体外恒温扩增体系， 39 °C恒温反应20  min， 获得特异性 RPA产物； （3） 利用RPA ‑CRISPR/Cas12a检测体系通过荧光检测法或免疫胶体金试纸条检测样品 中对虾急性肝胰腺坏死病核酸： 将步骤 （2） 的待检测特异性RPA产物加 入CRISPR/Cas12a检 测体系， 反应产物通过荧 光或免疫胶体金 试纸条进行检测。 3.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中RPA ‑CRISPR/Cas12a检测体 系荧光检测法的反应体系为20  μL： 1 μL 40 μM的Cas12a与1  μL 5 μM的PirAB ‑crRNA3在 37°C孵育10 min， 在Cas12a蛋白与PirAB ‑crRNA3的混合液中加入待检测特异性RPA产物， 以 及1 μL 250nM 的FAM‑TTATT‑TAMRA荧光探针， 反应中加入2  μL Cas Buffer， 其他用ddH2O 补足至20 μL， 在37 °C孵育20 min， 反应产物荧 光检测。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特征在于： 所述CRISPR/Cas12a检测体系的反应 体系中Cas12a与Pir AB‑crRNA3的浓度比例为8 :1。 5.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中RPA ‑CRISPR/Cas12a检测体 系免疫胶体金试纸条的反应体系为20  μL： 将1 μL 20 μM的Cas12a与1  μL 5 μM的PirAB ‑ crRNA3在37 °C孵育10 min后， 加入待检测 特异性RPA产物以及2  μL100 nM的 FAM‑TTATT‑ Biotin探针， 加入2  μL Cas Buffer， 用ddH2O补足， 37 °C孵育30 min； 孵育结束后， 向反应液 中再加入40  μL ddH2O混匀， 加入试纸条检测。 6.权利要求1所述试剂盒在对虾急性 肝胰腺坏死病检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350759 A 2基于CRISPR/Cas12a的对虾急性肝胰 腺坏死病快速检测试剂 盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及基于CRISPR/Cas12a技术开发的对虾急性肝 胰腺坏死病快速分子检测方法。 背景技术 [0002]急性肝胰腺坏死病 （acute  hepatopancreatic  necrosis  disease， AHPND） ， 也称 为早死病 （early  mortality  syndrome， EMS） 对水产虾类的养殖产量影 响十分严重。 根据相 关研究发现， 引起对虾急性肝胰腺坏死病的致病菌有多种， 包括副溶血弧菌 （ Vibrio  parahaemolyticus ） 、 哈维氏弧菌 （ Vibrio harveyi） 、 欧文斯氏弧菌 （ Vibrio owensii） 、 坎 氏弧菌 （Vibrio campbellii ） 等狐菌。 后续的研究发现， 只有当这些狐菌菌体内携带pVA1质 粒时才能致病， 而该质粒主要的毒力基因为杀昆虫毒素基因 （ Photorhabdus  insect‑ related， pir）pirVPA和pirVPB， 其表达的毒素蛋白为pirVPA和pirVPB。 出现急性肝胰腺坏死病 的对虾会表现出活力减弱、 空肠空胃、 肠粘膜脱落等症状， AHPND主要在凡纳滨对虾和 斑节 对虾中传播。 [0003]AHPND的分子诊断方式一般通过普通PCR、 巢式PCR （nested  PCR） 、 环介导的等温扩 增技术 （loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP） 、 重组酶聚合酶扩增 （recombinase polymerase amplification， RPA） 以及荧光实时定量PCR （real  time qPCR） 等方式对其毒力基因 pirVPA（GenBank： KM067908.1， （17198 ‑17533） ） 和 pirVPB（GenBank： KM067908.1， （17546 ‑18862） ） 进行扩增， 通过DNA琼脂糖电泳和荧光定量PCR仪等方式来检 测样本。 普通PCR的检测极限为10  pg， 而巢式PCR通过两步扩增的方式， 最低的检出DNA模板 可达100 fg。 很多权威检测机构都使用巢式PCR或者qPCR作为金标准。 区别于PCR的扩增方 式， LAMP和RPA都是通过恒温的方式扩增核酸， RPA通过重组酶， 单链结合蛋白， 链置换DNA聚 合酶在37 °C下即可进行目的核酸的扩增。  LAMP扩增核酸的方式为在65 °C下， 通过3对引物 对目的基因进行扩增， 与胶体金试纸条技术结合， 仅需要一个恒温仪器就可以在个体养殖 户等科研 设备较薄弱的地方对病虾进行检测。  RPA和LAMP在AHPND的检测中都有应用， 但是 由于LAMP会出现非特异性扩增的情况， 使检测的假阳性率升高， 且LAMP扩增目的基因需要 多条引物的参与， 也无法真正应用在临场快检当中。 [0004]Cas9蛋白作为C RISPR家族中最早被研究和开发的蛋白， 主要的作用是存在 于古菌 和细菌中抵抗外来病原体的入侵， 其机制为， Cas9与crRNA形成的复合物 二聚体， 在crRNA与 目的基因进行碱基互补配对， Cas9蛋白识别靶基因3 ’  端的PAM位点后被激活， 从而切割目 的基因， 使得外来病原体的核酸无法复制。 而Cas12a和Cas13a等CRISPR家族蛋 白经过研究 发现， 在识别靶基因后， 被激活的Cas12a和Cas13a还存