(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210046741.8 (22)申请日 2022.01.17 (71)申请人 科士华 （南京） 生物技 术有限公司 地址 210000 江苏省南京市江北新区新锦 湖路3-1号中丹生态生命科学产业园 一期B座6层、 B座715 -721室 (72)发明人 矫士平　彭澄　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C40B 50/06(2006.01) (54)发明名称 一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表 达量的试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明属于基因测序领域， 涉及一种检测人 HLA‑I/II类基因表 达分析和表达量的试剂盒， 包 含： 用于cDNA合成的逆转录试剂； 用于HLA ‑I/II 类基因捕获的HLA  Target Mix1； 用于HLA ‑I/II 类基因捕获的HLA  Target Mix2； 用于HLA ‑I/II 类基因捕获的PCR试剂； 用于捕获后DNA文库 构建 的试剂。 本发 明还提供了一种上述试剂盒的使用 方法： RNA逆转录合成cDNA及纯化； HLA靶向第一 次富集及纯化； HLA靶向第一次富集及纯化所得 产物的第二次富集及片段分选； 捕获文库构建。 本发明的试剂盒及使用方法， 能够更加真实地评 估细胞的免疫状态； 方法简单有效， 流 程稳定。 权利要求书4页 说明书9页 附图4页 CN 114525325 A 2022.05.24 CN 114525325 A 1.一种检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征在于， 包含以下组 分的试剂： （a） 用于 cDNA合成的逆转录试剂； （b） 用于 HLA‑I/II类基因捕获的HLA  Target Mix1； （c） 用于 HLA‑I/II类基因捕获的HLA  Target Mix2； （d） 用于 HLA‑I/II类基因捕获的PCR试剂； （e） 用于捕获后DNA文库构建的试剂。 2.根据权利要求1所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述逆转录试剂 （a） 包 含逆转录酶、 TSO引物、 Po ly d(T)引物、 Buf fer。 3.根据权利要求2所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述逆转录试剂 （a） 中的逆转录酶具有Template  Switch的功能， 能够在cDNA的5 ’端 加上通用的序列； 所述具有Template  Switch功能的逆转录酶可选自TransScript ® IV Reverse  Transcriptase、 TransScript ® II Reverse Transcriptase、 Vazyme  HiScript ®  Reverse Transcriptase、 Vazyme  HiScript ® II Reverse Transcriptase、 Vazyme   HiScript ® III Reverse Transcriptase、 Vazyme  M‑MLV(H‑) Reverse Transcriptase、 ABclonal ® ABScript  II Reverse Transcriptase、 ABclonal ® ABScript  III Reverse  Transcriptase、 Yeasen  Hifair® V Reverse Transcriptase、 Invitrogen  SuperScript ® IV Reverse Trascriptase。 4.根据权利要求2所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述TSO引物由已知的Ol igo和其3`端用于模板转换的1到多个碱基组成。 5.根据权利要求4所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述已知的Oligo和3`端用于模板转换的碱基之间， 还可以添加任意长度的碱基序 列。 6.根据权利要求2所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述Po ly d(T)引物由Ol igo d(T)10‑29序列和其5 ’端一段已知序列组成。 7.根据权利要求1所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述组成试剂 （b） HLA  Target Mix1由5’read 1引物、 靶向HLA ‑I的A、 B、 C基因的7号外 显子的引物、 HLA ‑II的DRB1、 DRA1、 D PA1、 DPB1、 DQA1、 DQB1基因4 号外显子的引物组成。 8.根据权利要求1所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述组成试剂 （c） HLA  Target Mix2由5’read 1引物、 靶向HLA ‑I的A、 B、 C基因 的6或7 号外显子的引物、 靶向HLA ‑II的DRB1、 DRA1、 DPA1、 DPB1、 DQA1、 DQB1基因4号外显子区域的引 物组成； 所述HLA Target Mix2中HLA‑II的靶向引物结合位点位于HLA  Target Mix1中HLA ‑II 的靶向引物的内侧。 9.根据权利要求7所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述HLA  Target Mix1的HLA ‑I的A、 B、 C基因的上游引物HLA ‑I Target Mix1‑F为： 5’ ‑ CAGACGCCGAGGATGGCC‑3’； 所述HLA Target Mix1的HLA ‑I的A、 B、 C基因的下游引物HLA ‑I Target Mix1‑R为： 5’ ‑权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114525325 A 2CAGAGCCCTGGGCACTGT‑3’； 所述HLA Target Mix1的HLA ‑II的DRB、 DRA、 DPA、 DPB、 DQA、 DQB基因的上游引物HLA ‑II  Target Mix1‑F为： DPA‑1： 5’ ‑ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT‑3’； DPB‑1： 5’ ‑ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC‑3’； DQA‑1： 5’ ‑ATGATCCTAAACAAAGCTCTG‑3’； DQB‑1： 5’ ‑GAARAAGKCTTTGCGGATCCC‑3`； DRA‑1： 5’ ‑ATGGCCATAAGTGGAGTCCC‑3’； DRB‑1： 5’ ‑GTGCTGAGCTC CCSACTGG‑3’； 所述HLA Target Mix1的HLA ‑II的DRB、 DRA、 DPA、 DPB、 DQA、 DQB基因的下游引物HLA ‑II  Target Mix1‑R为： DPA‑1： 5’ ‑TTATGATGAG GACGGTGCCC‑3’； DPB‑1： 5’ ‑ATGAAGATGCCCACTCCACA‑3’； DQA‑1： 5’ ‑CCTTCCAGGATGGGATTCACAAT‑3’； DQB‑1： 5’ ‑GATGATAAGGCCCAGCCCAA‑3’； DRA‑1： 5’ ‑GCTTTTGCGCAATCCCTTGAT‑3’； DRB‑1： 5’ ‑TCCTGAAGTAGATGA ACAGCCC‑3’。 10.根据权利 要求8所述的检测人HLA ‑I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒， 其特征 在于， 所述HLA  Target Mix2的HLA ‑I的A、 B、 C基因上游引物HLA ‑I Target Mix2‑F为： 5`‑ TGGCCCTGACCSAGACCTG‑3`； 所述HLA Target Mix2的HLA ‑I的A、 B、 C基因下游引物HLA ‑I Target Mix2‑R为： A‑2： 5’ ‑TCACACTTTACAAGCTGTGA ‑3’； B‑2： 5’ ‑TGCCAGAGGCTCTTGAAGTC‑3’； C‑2： 5’ ‑TGCAGAAAGAGATGC CAGAGG‑3’； 所述HLA Target Mix2的HLA ‑II的DRB、 DRA、 DPA、 DPB、 DQA、 DQB基因上游引物为HLA ‑II  Target Mix 2‑F为： DPA‑1： 5’ ‑ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT‑3’； DPB‑1： 5’ ‑ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC‑3’； DQA‑1： 5’ ‑ATGATCCTAAACAAAGCTCTG‑3’； DQB‑1： 5’ ‑GAARAAGKCTTTGCGGATCCC‑3’； DRA‑1： 5’ ‑ATGGCCATAAGTGGAGTCCC‑3’； DRB‑1： 5’ ‑GTGCTGAGCTC CCSACTGG‑3’； 所述HLA Target Mix2的HLA ‑II的DRB、 DRA、 DPA、 DPB、 DQA、 DQB基因下游引物HLA ‑II  Target Mix2‑R为： DPA‑2： 5’ ‑TTATGATGAG GACGGTGCCC‑3’； DPB‑2： 5’ ‑CCACTCCACAGATGATGAGC ‑3’； DQA‑2： 5’ ‑TTCCAGGATGGGATTCACAATG