(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210188616.0 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 中国食品药品检 定研究院 地址 100050 北京市东城区天坛西里2号 (72)发明人 张文娟　魏锋　马双成　程显隆　 余坤子　姚令文　麻思雨　 (74)专利代理 机构 北京攀腾 专利代理事务所 (普通合伙) 11374 专利代理师 彭蓉　游舜华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种探针引物及其用于松贝/青贝专属性检 测的荧光定量PCR检测方法和用途 (57)摘要 本发明提供了一种探针引物及其用于松贝/ 青贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用 途。 所述探针引物是由SEQ  ID NO： 1‑21所示的 DNA序列组成。 所述检测方法专属性强， 灵敏度 高， 可用于药材、 饮片或成方制剂中是否存在松 贝/青贝的定性或定量检测， 具有重要的实用价 值和应用前 景。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 114438252 A 2022.05.06 CN 114438252 A 1.一种探针引物， 其特征在于， 所述探针引物是由SEQ  ID NO： 1‑21所示的DNA序列组 成。 2.一种用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量PCR检测方法， 其特征在于， 包括下述步 骤： 称取贝母样品及样品前处 理； 从所述样品中提取DNA并制备DNA模板； 及 选择探针引物； 优化反应条件； 根据不同的检测需求， 设定不同的判定依据。 根据不同的检测需求， 设定不同的判定依据； 其中对于定性检测， 根据设定的CT值临界 点判定是否检出； 对于 半定量检测,根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据,差 值越小,含量越高； 对于定量检测,一方面同时设置标准品(S),另一方面采用同体系中双探 针标记进行扩增,即包括目的探针(P)和内参探针(C)； 供试品中专属探针(P)和通用探针 (C)的定量检测比值可表示为 △CT(T),相应的标准品可表示为 △CT(S),△△CT＝△CT(T)‑ △C T ( S ) 从 而 目 的 D N A ( 松 / 青 贝 母 ) 所 占 比 例 计 算 公 式 可 表 示 为 ： 其中， 所述方法能够用于检测所述样品中是否含有松贝/青贝； 所述探针引物为权利要 求1所述的探针引物。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中每组探针引物包括三个序列， 并且当任何一组用于 检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。 4.根据权利要求2所述的方法， 其中所述样品为中药 材、 饮片或 成方制剂。 5.根据权利要求2所述的方法， 其中所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量 和纯度测定 。 6.根据权利要求2所述的方法， 其中所述反应条件包括： 94℃预变性5min， 94℃变性 30s， 60℃退火30～60s， 60℃收集荧光。 根据所选反应预混液性质的不同， 反应条件可进行 调整。 7.一种探针引物 的用途， 其特征在于， 所述探针引物为权利要求1所述的探针引物组； 所述探针引物通过荧 光定量PCR检测方法实现松贝/青贝专属性检测。 8.根据权利要求7所述的用途， 其中每组探针引物包括三个序列， 并且当任何一组用于 检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。 9.根据权利要求7 所述的用途， 其中检测的样品为中药 材、 饮片或 成方制剂。 10.一种试剂 盒， 其特征在于， 含有权利要求1所述的探针引物， 并且所述试剂 盒用于松 贝/青贝专属性检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438252 A 2一种探针引物及其用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量PCR 检测方法和用途 技术领域 [0001]本发明属于医药技术领域， 涉及药物鉴别检测方法， 尤其涉及一种探针引 物及其 用于松贝/青贝专属性检测的荧 光定量PCR检测方法和用途。 背景技术 [0002]川贝母是常用大宗药材， 被视为止咳化痰良药。 《中国药典》 川贝母的基原收录了 百合科植物的6个物种， 即川贝母Fritillaria  cirrhosa D.Don、 暗紫贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、 甘肃贝母F.przew alskii Maxim.、 梭砂贝母F.delavayi  Franch.、 太 白贝母F.taipaiensis  P.Y.Li或瓦布贝母F.unibracteata  Hsiao et K.C.Hsia   var.wabuensis(S.  Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang  et S.C.Chen， 按性状差异又可 分为松贝、 青贝、 炉贝及栽培品。 传统认为川贝母以松贝和青贝为佳， 市场价格最贵， 其他贝 母冒充或者 掺伪的现象比较多见。 松贝和青贝对应的物种为川贝母、 暗紫贝母和甘肃贝母。 发明内容 [0003]本发明提供了一种探针引 物及其用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量PCR检测 方法和用途。 所述探针引物和 检测方法能够用于药材、 饮片及相关产品(如成方制剂)中松 贝和/或青贝的定性或定量检测， 从而客观评价川贝母药材、 饮片及相关产品的质量和等级 划分， 具有重要的实用价 值和应用前 景。 [0004]一方面， 本发明提供了一种探针引物。 所述探针引物其由SEQ  ID NO： 1‑21所示的   DNA序列组成。 [0005]另一方面， 本发明提供了一种用于松贝/青贝专属性检测的荧光定量PCR检测方 法。 所述方法包括下述 步骤： [0006]称取贝母样品及样品前处 理； [0007]从所述样品中提取DNA并制备DNA模板； 及 [0008]选择探针引物； [0009]优化反应条件； [0010]根据不同的检测需求， 设定不同的判定依据； 其中对于定性检测， 根据设定的CT   值临界点(如CT<35)判定是否检出； 对于半定量检测， 根据与阳性对照的CT值之差的绝对值 作为判定依据， 差值越小， 含量越高； 对于定量检测， 一方面同时设置标准品  (S)， 另一方面 采用同体系中双探针标记进行扩增， 即包括目的探针(P)和内参探针  (C)； 供试品中目的探 针(P)和内参探针(C)的定量检测比值可表 示为△CT (T)， 相应的标准品可表示为 △CT(S)， △△CT＝△CT(T)‑△CT(S)从而目的  DNA(松贝/青贝)所占比例计算公 式可表示为： 供试品 (T)/标准品(S)％＝2 ‑△△CT绝对 值×100％； [0011]其中， 所述方法能够用于检测所述样品中是否含有松贝/青贝； 所述探针引物为序 列号为SEQ ID NO1‑21的探针引物。说　明　书 1/9 页 3 CN 114438252 A 3