(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210161576.0 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 贵州茅台酒股份有限公司 地址 564501 贵州省遵义市仁怀市茅台镇 河滨南路 (72)发明人 杨帆　罗寒　吕锡斌　傅文博　 杜海　陈良强　王莉　徐岩　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 林娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸 片段的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于绝对定量鉴定酿酒 酵母中L/M核酸片段的方法， 属于生物工程技术 领域。 本发明提供了一种鉴定酿酒酵母L  dsRNA 和酿酒酵母M  dsRNA的SYBR  Green I荧光定量方 法， 此方法为先将一定浓度梯度的重组质粒进行 SYBR Green I荧光定量， 建立质粒浓度与CT值的 标准曲线， 再提取样本微生物RNA逆转录为cDNA 进行SYBR  Green I荧光定量， 以标准曲线公式为 依据， 直接计算得到酿酒酵母L  dsRNA和酿酒酵 母M dsRNA片段的浓度， 以达到快速绝对定量的 目的。 本发明旨在快速、 准确检测发酵微生物中 酿酒酵母 L dsRNA和酿酒酵母M  dsRNA的含 量， 进 而为揭示其在白酒发酵过程中的影 响、 作用和演 替规律， 同时为提高白酒的品质奠定基础， 具有 较高的实际应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图5页 CN 114480712 A 2022.05.13 CN 114480712 A 1.检测酿酒酵母中L/M核酸片段的引物组合， 其特征在于， 包含检测L  dsRNA的引物对A 和/或M dsRNA的引物对B； 引物对A的上游引物的序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游引物的序列如SEQ  ID NO.2所示； 引物对B的上游引物的序列如SEQ  ID NO.3所示， 下游引物的序列如SEQ  ID NO.4所示。 2.一种检测试剂盒， 其特 征在于， 含有权利要求1所述的引物组合。 3.根据权利要求2所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒还含有标准样品， 所述标准样品为过表达L  dsRNA和/或M  dsRNA基因片段的阳性质粒。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， L  dsRNA的基因片段的核苷酸序列 如SEQ ID NO.5所示， M  dsRNA基因片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 5.根据权利要求2所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒的反应体系如下： Mixture 10 μL， 上游引物、 下游引物各0.4 μL， DNA 2 μL， ddH2O补足至20 μL。 6.根据权利要求2所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒的扩增程序为： 94 ℃2min， 94℃30s， 55℃45s， 72℃3 0s， 35个循环， 72℃3 0s。 7.一种检测检测酿酒酵母中L/M核酸片段的方法， 其特征在于， 所述方法为使用权利要 求1所述的引物组合或权利要求2 ～6任一所述的试剂盒。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述方法为提取微生物RNA， 反转录得到 cDNA， qPCR检测得到的数值代入标准曲线获得L  dsRNA或M  dsRNA的拷贝数。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 当测定L  dsRNA时， 标准曲线公式为y＝ ‑ 3.8305x+41.259， 当测定 M dsRNA时， 标准曲线公式为y＝ ‑3.3286x+38.982。 10.权利要求1所述引物组合或权利要求2～6任一所述检测试剂盒或权利要求7～9任 一所述的方法在酿造领域方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480712 A 2一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方 法 技术领域 [0001]本发明公开了一种基于绝对定量鉴定酿酒酵母中L/M核酸片段的方法， 属于生物 工程技术领域。 背景技术 [0002]酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)， 又称面包酵母或者出芽酵母。 酿酒酵母 是与人类关系最广泛的一种酵母， 用于制作面包和馒头等食品及酿酒， 是发酵中最常用的 生物种类。 酿 酒酵母具有生长周期短、 发酵能力强等优点， 一直是基础研究与应用研究 的主 要对象， 并且在食品、 医药等领域具有广泛的应用。 [0003]研究发现， 含有L/M核酸片段的酿酒酵母产生的某类因子或外毒素能够抑制或杀 死某些特定的微生物， 但对自身 具有免疫功能。 这类酵母分泌的因子通常作用于同种、 亲缘 关系比较近的酵母菌或者野生酵母菌的细胞 受体， 最近几年 发现上述因子也可以抑制或杀 死丝状真菌或细菌 。 [0004]一般情况下， 在酿酒酵母细胞中， 有两种核外双链RNA 所编码的蛋白质和这种现象 有关： 一种是分子量约为2.5 ×106道尔顿的大分子双链RNA(Large  dsRNA， 简称L  dsRNA， 长 度约为4.5kb)， 占90％以上； 另一种 是分子量约为1～1.4 ×106道尔顿的中等分子双链RNA (Medium dsRNA， 简称M  dsRNA， 长度约为1.8kb)， 占6％左右。 两者的总和约占酿酒酵母细胞 全部核酸的0.1％， 且不同的酿酒酵母菌株中含有不同的M  dsRNA， 编码合成和分泌不同的 因子， 表现出不同的表型。 [0005]具有类似现象的酵母菌株， 可从各种自然栖息地(如水， 土壤， 水果和葡萄园)和不 同的地理区域分离得到， 该类酵母成为占据着微生物群落生态位的优势种类时， 可能会造 成体系的发酵迟缓甚至停滞， 导致 发酵速度和产 物质量下降。 目前， 该类型酵母在世界范围 内葡萄酒、 清酒等酿造过程中均被发现 并证明对酒类发酵存在影响。 同时， 研究发现酿 酒酵 母中L/M核酸片段的存在可能会干扰白酒酿造过程中微生物的组成和演替速度， 进而影响 白酒的品质。 因此， 亟需一种快速、 准确的定量检测方法， 帮助我们进一步揭示其在白酒酿 造过程中的影响、 作用与演替规律， 进而减少其对发酵过程的干扰， 为提高和改善白酒的品 质、 风味奠定基础。 发明内容 [0006]本发明要解决的技术问题是提供一种准确度高的大分子双链RNA(酿酒酵母L   dsRNA和酿酒酵母M  dsRNA)绝对定量的方法。 [0007]为解决上述技术问题， 本发明提供了一组检测大分子双链RNA(酿酒酵母L  dsRNA 和酿酒酵母M  dsRNA)的引物组合和方法。 [0008]本发明的第一个目的是提供检测酿酒酵母中L/M核酸片段的引物组合， 所述引物 组合包含检测L dsRNA的引物对A和/或M  dsRNA的引物对B。 [0009]在一种实施方式中， 所述引物对A的上游引物的序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游引说　明　书 1/6 页 3 CN 114480712 A 3