(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210128562.9 (22)申请日 2022.02.11 (71)申请人 南方医科 大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙 太南 路1023号-10 63号 (72)发明人 郝文波　黄颖而　陈佳灵　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 代理人 李瑞雨 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA -CRISPR/Cas12a的人型支原体 检测系统及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于RPA ‑CRISPR/Cas12a 的人型支原 体检测系统及其应用， 涉及微生物检 测领域； 所述检测系统包括RPA扩增引物对、 探 针、 crRNA和AsCas12a蛋白； 所述RPA扩增引物对 为如SEQ ID NO:3和SEQ  ID NO:4所示序列； 所述 探针的序列为SEQ  ID NO:16所示序列； 所述 crRNA为SEQ  ID NO:10‑12任一项所示序列。 本发 明基于该RPA ‑CRISPR/Cas12a检测系统构建的三 种快速核酸检测人型支原体的方法增加了检测 的灵敏度， 并且本发明方法显示出具有极高的特 异性， 为人型支原体的检测提供了新的技术平 台。 权利要求书2页 说明书18页 序列表4页 附图5页 CN 114395636 A 2022.04.26 CN 114395636 A 1.一种基于RPA ‑CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统， 其特征在于， 所述检测系统包 括RPA扩增引物对、 探针、 crRNA和AsCas12a 蛋白； 所述RPA扩增引物对的序列为如SEQ  ID NO:3和SEQ  ID NO:4所示序列； 所述探针的序列为SEQ  ID NO:16所示序列； 所述crRNA的序列为SEQ  ID NO:10‑12任一项所示序列。 2.根据权利要求1所述的基于RPA ‑CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统， 其特征在 于， 所述crRNA的制备方法为： 先按照SEQ  ID NO:7‑9任一项所示的DNA单链制备DNA体外转 录模板， 再根据所述DNA体外转录模板转录制备得到所述crRNA； 其中， SEQ  ID NO:10所示 crRNA按照SEQ  ID NO:7所示的DNA单链制备得到， SEQ  ID NO:11所示crRNA按照SEQ  ID NO: 8所示的DNA单链制备得到， SEQ  ID NO:12所示crRNA按照SEQ  ID NO:9所示的DNA单链制备 得到。 3.根据权利要求1所述的基于RPA ‑CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统， 其特征在 于， 所述crRNA的序列为SEQ  ID NO:12所示序列。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的基于RPA ‑CRISPR/Cas12a的人型支原体检测系统在 制备检测人 型支原体的试剂盒中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒检测人型支原体的方法包括以 下步骤： (1)以待测菌的基因组DNA为模板， 采用所述的RPA扩增引物对进行RPA扩增， 得到RPA扩 增产物； (2)配制CRISPR/Cas12a反应液， 所述CRISPR/Cas12a反应液包括所述的探针、 crRNA和 AsCas12a 蛋白， 以及步骤(1)制备的RPA扩增产物； 所述探针一端标记FAM， 另一端标记BHQ； (3)利用步骤(2)制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应， 之后对荧光强 度进行检测。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒检测人型支原体的方法包括以 下步骤： (1)以待测菌的基因组DNA为模板， 采用所述的RPA扩增引物对进行RPA扩增， 得到RPA扩 增产物； (2)配制CRISPR/Cas12a反应液， 所述CRISPR/Cas12a反应液包括所述的探针、 crRNA和 AsCas12a蛋白， 以及步骤(1)制备的RPA扩增产物； 所述探针一端标记FITC， 另一端标记 Biotin； (3)利用步骤(2)制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应， 之后用胶体金 侧流层析 试纸条进行检测。 7.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒检测人型支原体的方法包括以 下步骤： (1)以待测菌的基因组DNA为模板， 采用所述的RPA扩增引物对进行RPA扩增， 得到RPA扩 增产物； (2)配制CRISPR/Cas12a反应液， 所述CRISPR/Cas12a反应液包括所述的探针、 crRNA和 AsCas12a蛋白， 以及步骤(1)制备的RPA扩增产物； 所述探针一端标记FITC， 另一端标记 Biotin；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114395636 A 2(3)利用步骤(2)制备的CRISPR/Cas12a反应液进行CRISPR/Cas12a反应， 之后用时间分 辨铕标微球免疫层析 试纸条进行检测。 8.一种检测人型支原体的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3任一项所述的基于 RPA‑CRISPR/Cas12a的人 型支原体检测系统。 9.根据权利要求8所述的检测人型支原体的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括胶 体金侧流层析 试纸条或时间分辨铕标微球免疫层析 试纸条。 10.根据权利要求8所述的检测人型支原体的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒通过检 测荧光强度显示检测结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114395636 A 3