ICS65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3258—2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程 Technical code of practice for in vitro identification of resistance to Sclerotinia Sclerotiorumin oilseed rape 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3258—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部农产品质量安全监管司提出。 本标准由农业农村部种植业管理司归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所。 本标准主要起草人：伍晓明、李利霞、陈碧云、闫贵欣、高桂珍 行业标准信息服务平台 I NY/T3258—2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了油菜菌核病抗性离体鉴定方法。 本标准适用于油菜菌核病室内抗病鉴定。 本标准不适用于油菜季节性和形态学 （如无花瓣油菜）避病的抗病鉴定。 2 规范性引用文件 件。凡是不注日期的引 用文件 文件 GB/T6682 析实 各和 试验方 NY/T3068 3 术语和定义 义适用 下列术语 和定 3. 1 SCETO 油菜菌核病 rinid stem rot ofoilseed rape 由病原物核 rotinias 钓油菜真 参见附录A)。 3.2 U caffon 离体人工接 种抗病 dentifi 将器官或部 分组幼 造 发病条件，根 部分 据接种植物器 试材料抗 吸别的 3. 3 病情指数 diseasejnd 反映群体抗性程 .(1) 式中： DI 病情指数； 各单株病情级别数值（ 12、3、4)： s 务平台 对应各病情级别的株数，单位为株 n N 调查总株数，单位为株； 最高病情级别的数值。 3. 4 相对抗性指数 relative resistance index 反映群体较对照群体抗性减轻程度的综合指标，按式（2）计算。 100-DI RRI = In( In (2) DIck DI 式中： RRI 相对抗性指数； 1 NY/T3258—2018 DIck抗病对照的病情指数； DI—待评价品种（系）的病情指数。 4试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水 GB/T6682，三级 4.21mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液 称取40.0g氢氧化钠，溶于800mL水中，冷却至室温。 4.31mol/L盐酸(HCI)溶液 量取50mL浓盐酸（36%~38%）加人到体积为450mL的水中，混匀。 4.470%乙醇溶液 量取700mL95%乙醇，加水定容至950mL，混匀。 4.51%次氯酸钠溶液 量取10mL有效氯含量10%的次氯酸钠原液加人到体积为90mL的水中，混匀。 5仪器设备 5.1电子天平 感量0.01g。 5.2恒温培养箱 精度±1℃。 5.3人工接种鉴定温室 温度可调节至（22士1)℃，相对湿度可调节至（95士5）%。 6核盘菌接种体制备 6.1核盘菌接种体培养基制备 核盘菌生长培养基用市售马铃薯培养基（PDA，PotatoDextroseAgar）粉剂，按说明书标准用量的 一半，并按每升培养基补加7.5g琼脂粉，加水溶解，定容至1000mL，用1mol/LNaOH或1mol/L HCl溶液调节pH至5.8。之后，将溶液分装到三角瓶中，包扎好后121℃灭菌20min取出，按20mL/ 皿倒平板（直径90mm培养皿），冷却后储存备用。 6.2核盘菌菌核的采集和消毒 从田间直立的油菜菌核病发病植株体内剥离核盘菌菌核选择颗粒饱满、无裂痕、无霉变的菌核放 6.3核盘菌菌丝的扩繁 在超净工作台上，将已消毒的菌核切成2mm×2mm（长×宽）的小块。用镊子取一个菌核切块置 于培养血中心，并使其切面紧贴培养基表面，封血后（22土1)℃暗培养。萌发菌丝后，4℃保存并将此培 养基用作菌源。离体接种前5d，用直径5mm的打孔器沿菌源培养基菌丝边缘打孔。将打孔得到的菌 丝块取出置于新的培养基中心，并使菌丝块有菌丝一面紧贴于新的培养基表面，封血后（22土1）℃暗培 养3d。待菌丝正好长至培养基边缘时，取出按上述步骤扩繁，（22土1)℃暗培养约2d后备用。 7菌核病抗性离体鉴定方法 7.1# 苗期离体叶片鉴定 2 NY/T3258—2018 7.1.1取样 按各地正常播种时间播种待鉴定油菜材料，播种材料应包含抗病对照和感病对照。出苗后8周～ 10周，取健康油菜幼苗从心叶向外数的第2片完全展开叶，正面朝上置于底部铺好湿纱布（纱支：21s× 21s，经纬度：120X100根/100mm）的塑料盒中或接种床上。 7.1.2人工接种 用直径5mm打孔器沿菌丝边缘打孔取菌丝块，用镊子将菌丝块接种于所取叶片中上部并偏离主 叶脉的位置，使菌丝块有菌丝一面紧贴叶片。接种后用水喷雾并用塑料薄膜覆盖保湿，放置于（22士 1)℃、相对湿度（95士5）%的人工接种鉴定温室中培养。每份材料选择30片均匀一致的叶片接种。 7.1.3调查方法 以接种处的水渍边缘作为病斑边缘，接种2d后测量椭圆形病斑长径和短径。大批量鉴定时，调查 病斑顺序，尽量和接种顺序保持一致。调查时，对发病材料的病斑进行图片采集。图片采集时，应放置 参照标尺。整个试验发病情况的调查应在1d之内完成，如有特殊情况应在记录表备注栏中标出，调查 数据及时录人记载中（参见附录B中的B.1)。 7.1.4病斑面积计算 病斑面积按式（3）计算。 Sz=（元XaXb) (3) 式中： 待测材料的病斑面积，单位为平方厘米（cm）； 待测材料的病斑长径，单位为厘米（cm）； D 6 待测材料的病斑短径，单位为厘米（cm）。 7.2终花期离体茎秆鉴定 7.2.1取样 按各地正常播种时间播种待鉴定材料，播种材料应包含抗病对照和感病对照。在大田材料处于终 花期时，选择正常且长势一致（株高、株型、叶片大小等相似）的植株，截取离地20cm～50cm之间长为 30cm的茎秆，两端用保鲜膜包住保湿，置于底部铺好湿纱布的塑料盒中或接种床上。 7.2.2人工接种 用直径5mm打孔器沿菌丝边缘打孔取菌丝块，用镊子将菌丝块接种于所取茎秆的两茎节中间位 置，并使菌丝块有菌丝一面紧贴茎杆表面。接种后喷雾并用塑料薄膜覆盖保湿，放置于（22土1）℃、相对 湿度（95土5）%的人工接种鉴定温室中培养每份材料接种30株。 7.2.3调查方法 以接种处的水渍边缘作为病斑边缘，接种后5d调查病斑长度。在进行大批量鉴定时，调查病斑顺 序尽量和接种顺序保持一致。调查时对发病材料进行图片采集，图片采集时应放置参照标尺。整个试 验发病情况的调查应在1d之内完成，如有特殊情况应在记录表备注栏中标出，调查数据及时录人记载 表中（参见B.2)。 8试验数据处理 如果单株测量值满足式（4），可认为该单株值为异常值，在后续的分析中可予以剔除。 IS-S>3g (4) 式中： 单株测量值，单位为平方厘米或厘米（cm或cm）； 样本平均值，单位为平方厘米或厘米（cm或cm）； NY/T3258—2018 样本标准差，单位为平方厘米（cm²）或厘米（cm）。 9 油菜单株抗性分级 9.1 苗期离体叶片单株抗性分级 根据四分位分类法则，将病害等级分为5级： 0级：无病斑； 一分位点值)； 1级：0<S2<So.25（ 2级:So.25<S2<So.5( 分位点值）； 3级：So.5<S2<S.75( 4级：So.75<S2。 9.2终花期离体茎秆单株抗性分级 根据四分位分类法则，将病害等级分为5级： 0级：无病斑； 3级：So.5<L<So.75（ 4级：So.75<L。 10病情指数和相对抗性指数的计算 根据记录结果和式（1）、式（2)分别计算病情指数和相对抗性指数 抗性评价 对油菜材料的抗性评价根据NY/T3068的规定按照表1的标准进行 表1油菜菌核病室内离体鉴定抗性评价标准 抗性评价 相对抗性指数(RRI) 高抗（HR) RR-1.2 中抗（MR) 低抗(R) 0.7<RRI<0 低感（S) 0<RRI<0.9 中感(MS) 0.9<RR<2.0 高感(HS) RRI>2.0 NY/T3258—2018 附录A （资料性附录） 油菜菌核病 A.1病原菌 A.1.1学名 中文学名：核盘菌。 拉丁学名：Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary 分类地位：子囊菌门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘菌科、核盘菌属。 A.1.2形态描述 菌核黑色，不规则形，由暗色的皮层和无色的髓部构成；子囊盘生于菌核上，盘状，中央凹陷，具柄； 子实层米色、肉桂色或淡褐色，子层托颜色稍淡于子实层，柄基部暗色；外囊盘被为角胞组织，外层细胞 近球形、椭圆形或长形，细胞纵轴与囊盘被表面垂直；盘下层为交错丝组织，菌丝无色；子实下层发育不 健全，厚15μm~30μm；子实层厚127μm~150μm；子囊近圆柱形，具8个子囊孢子；子囊孢子椭圆形至 近梭形，无色，单细胞，在子囊中单列排列。 A.2病害症状 油菜叶片感病后初生暗青色水渍状斑块，后扩展成圆形或不规则形大斑。病斑灰褐色或黄褐色，有 同心轮纹，外围暗青色。油菜茎秆染病初期为灰白的水渍状病斑，随后发展为具轮纹状的长条斑，边缘 褐色。发病组织在空气干燥时萎缩、干枯，潮湿时则长出白色棉絮状菌丝。发病后期病茎表皮开裂，露 出麻丝状的维管束，病茎内髓部烂成空腔，内部形成形状、大小不一的黑色鼠类状菌核。田间茎秆发病 实