ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 39670—2020 宠物饲料中硝基呋喃类代谢物残留量的 测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of nitrofuran metabolites in pet feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020-12-14发布 2021-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T39670—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国南京海关、中华人民共和国淮安海关、江苏海企长城股份有限公 司、淮阴师范学院。 本标准主要起草人：蒋原、何健、魏云计、宦海霞、朱臻怡、冯民、王远见、柯家法、张扬、张科、张敬友 5AG GB/T39670—2020 宠物饲料中硝基呋喃类代谢物残留量的 测定液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了宠物饲料中硝基味喃类代谢物（3-氨基-2-唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮、 1-氨基-乙内酰脲、氨基脲)残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于以动物源性成分为主要原料制成的宠物饲料中硝基呋喃类代谢物（3-氨基-2-唑酮、 5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲、氨基脲)残留量的测定。 本标准的检出限为0.25μg/kg，定量限为0.5μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AOZ:3-氨基-2-唑酮（3-amino-2-oxalidinone） AMOZ：5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxalidinone) AHD1-氨基-乙内酰脲（1-amino-hydantoin） SEM：氨基脲（semicarbazide) 原理 4 试样经三氯乙酸沉淀蛋白质，游离出硝基呋喃类代谢物，在避光条件下用邻硝基苯甲醛衍生化、乙 酸乙酯提取后，用液相色谱-串联质谱仪检测，同位素内标法定量 5 试剂或材料 除非另有规定外，仅使用分析纯试剂。 5.1水:GB/T 6682,一级。 5.2 乙：色谱纯。 5.3 乙酸铵：色谱纯。 5.4 甲酸：色谱纯。 5.5 甲醇：色谱纯。 5.6 二甲基亚砜。 1 GB/T39670—2020 5.7正已烷。 5.8乙酸乙酯。 5.9邻硝基苯甲醛。 5.11 邻硝基苯甲醛衍生试剂（50mmol/L）：称取0.0378g邻硝基苯甲醛（5.9）溶于5mL二甲基亚砜 (5.6)中。现用现配。 5.12磷酸氢二钾溶液（1.0mol/L）：称取17.4g无水磷酸氢二钾溶于100mL水中。 5.13乙酸铵缓冲液（0.5mmol/L）：称取0.0385g乙酸铵（5.3）溶于500mL水中，加人200uL甲酸 （5.4），用水定容至1000mL。 5.14样品溶解液：分别量取10mL乙睛（5.2）和90mL乙酸铵缓冲液（5.13），混合均匀。 5.15乙睛饱和正已烷：量取80mL正已烷（5.7）于100mL分液漏斗中，加人适量乙睛后，剧烈振摇， 静置分层后，弃去乙睛层。 5.16标准品：AOZ(CAS:80-65-9)、AMOZ(CAS:43056-63-9)、AHD·HCI(CAS:2827-56-7)、SEM· HCI(CAS:563-41-7)。纯度≥99.0%。 5.17硝基呋喃类代谢物同位素内标：D-AOZ、D5-AMOZ、13C3-AHD、13C15Nz-SEM·HCl。纯度 ≥99.0%。 5.18标准储备溶液：分别准确称取适量硝基喃类代谢物标准品（5.16），用甲醇（5.5）溶解定容，配制 成浓度约为1.0mg/mL的标准储备液。一18℃以下避光保存，有效期为6个月。 5.19混合标准中间溶液：分别准确移取标准储备溶液（5.18）各1mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度，配制成浓度约为10μg/mL的混合中间标准溶液。一18℃以下避光保存，有效期为3个月。 中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度分别为100ng/mL和10ng/mL的混合标准工作溶液。4℃避光保 存，有效期为7天。 5.21同位素内标储备溶液：分别准确称取适量硝基喃类代谢物同位素内标（5.17），用甲醇（5.5）溶解 下避光保存，有效期为3个月。 5.23同位素内标混合标准工作溶液：准确移取同位素内标混合标准中间溶液（5.22)0.1mL于10mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度约为100ng/mL的同位素内标混合标准中间溶液。4℃避 光保存，有效期为7天。 5.24微孔滤膜：0.22μm，有机系。 6仪器设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 6.2分析天平：感量0.01mg和0.01g。 6.3水浴恒温振荡器：37℃土1℃。 6.4离心机：转速不低于8000r/min。 6.5涡旋混匀器。 6.6氮吹仪。 2 GB/T39670—2020 7样品 固态样品按GB/T20195进行样品制备，高速研磨仪粉碎，转速10000r/min以上，过0.42mm孔 径筛，混勾装于密封容器，备用。 半固态样品按GB/T20195进行样品制备，用高速均质器均质，转速12000r/min以上，均质后装 于密封容器，备用 试样置于一18℃避光保存。 8 3试验步骤 8.1衍生 平行做两份试验。称取试样2g，准确至0.01g，置于50mL具塞离心管中，准确加入0.05mL同位 素内标混合标准工作溶液（5.23），4mL水（5.1）和2.0mL三氯乙酸溶液（5.10），涡旋1min后，加入 8.2提取 备用液（8.1)用磷酸氢二钾溶液（5.12）调节pH至7.0~7.5，加人8mL乙酸乙酯（5.8），涡旋1min， 于8000r/min离心5min，吸取上清液。残留物再加人8mL乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液， 40℃下氮气吹干，加入1.0mL样品溶解液（5.14）充分溶解，再加人1.0mL乙睛饱和正已烷（5.15）涡 旋，于8000r/min离心1min，吸取下层溶液，过0.22μm滤膜后，待测。 8.3 标准曲线的制备 准确移取10ng/mL和100ng/mL混合标准工作溶液（5.20)0.20mL、0.10mL和0.05mL，分别置 于50mL离心管中，按8.1和8.2进行衍生和提取。 8.4测定 8.4.1液相色谱参考条件 色谱柱：Cls柱，柱长100mm，内径2.0mm，粒径5μm，或性能相当者； 柱温：35℃； 流速：0.25mL/min； 进样量：10μL； 流动相：A：乙（5.2），B：乙酸铵缓冲溶液（5.13），梯度洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间/min A/ % B/ % 0.00 10 90 2.50 10 06 6.30 95 5 7.50 66 5 7.60 10 90 11.0 10 06 3