ICS11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T26436—2010 禽 白血病诊断技术 Diagnostictechniquesforavianleukosis 2011-01-14发布 2011-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录,附录G、附录H为资料性 附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SC/TC181)归口。 本标准起草单位:山东农业大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学。 本标准主要起草人:崔治中、孙淑红、赵鹏、杨素、沙才华、廖明、曹伟胜。 ⅠGB/T26436—2010 引 言 禽白血病病毒(avianleukosisviruses;ALV)为反转录病毒科的α反转录病毒属,可诱发鸡不同组 织的良性和恶性肿瘤,是鸡群中除马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)外的又一 类重要的致肿瘤病毒。 禽白血病是一类由ALV相关的反转录病毒引起鸡的不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。随发生 肿瘤的主要细胞成分不同,分别称之为不同名称的肿瘤。ALV可分为A~J10个亚群,其中仅A亚 群、B亚群、C亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡相关。A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群属外 源性ALV,与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。E亚群病毒基因组可完整地整合进感染鸡的染色体 基因组并稳定地遗传下去,也可从中再复制出传染性病毒颗粒,因而称之为内源性病毒。此外,在一些 鸡的染色体的不同部位,还可能带有一些ALV的基因组片段。E亚群ALV的致病性很低或没有致病 性,不属于净化对象,但很多鸡群中包括一些无特定病原(SPF)鸡群都可能带有E亚群内源性ALV,它 的感染不会给鸡群带来不良影响,但会干扰检测。 目前,该病对我国养鸡业的危害很大。在国际种禽贸易中,外源性白血病病毒感染是最主要的检测 对象之一。 ⅡGB/T26436—2010 禽白血病诊断技术 1 范围 本标准规定了病料中ALV特异血清抗体和外源性ALV的检测方法。 本标准适用于判断鸡群或病料中是否有外源性ALV感染。 2 临床症状和病理变化 ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡,感染率和发病死亡率高低不等,死亡率最高可 达20%。一些鸡感染后虽不发生肿瘤,但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。 淋巴样白血病是最为常见的经典型白血病肿瘤,肿瘤可见于肝、脾、法氏囊、肾、肺、性腺、心、骨髓等 器官组织,肿瘤可表现为较大的结节状(块状或米粒状),或弥漫性分布细小结节。肿瘤结节的大小和数 量差异很大,表面平滑,切开后呈灰白色至奶酪色,但很少有坏死区。在成红细胞性白血病、成髓性细胞 白血病、髓细胞白血病中,多使肝、脾、肾呈弥漫性增大。J亚群ALV感染主要诱发髓细胞样肿瘤,它最 常见的特征性变化主要为肝脾肿大或布满无数的针尖、针头大小的白色增生性肿瘤结节。在一些病例 中,还可能在胸骨和肋骨表面出现肿瘤结节。 单纯苏木精伊红染色(H.E染色)的病理组织切片观察在诊断上有一定参考意义。在表现为淋巴 样细胞肿瘤结节时,要注意与马立克氏病病毒(MDV)和禽网状内皮增生症病毒(REV)诱发的肿瘤相 区别;在表现为髓样细胞瘤时,既要与REV诱发的类似肿瘤细胞相区别,也要与嗜中性白细胞浸润性 炎症相区别,如鸡戊型肝炎病毒感染引起的肝局部炎症。最终的鉴别诊断以肿瘤组织中的病毒抗原检 测或病毒分离鉴定为最可靠依据。 3 病毒的分离培养、检测和鉴定 3.1 试剂和仪器 3.1.1 试剂 DMEM液体培养基(pH7.2)、0.25%胰酶、磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBS,pH7.2)、抽提缓冲液、 青霉素(10万U/mL)、链霉素(10万U/mL)、抗ALV单抗、抗ALV单因子鸡血清、异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的山羊抗小鼠IgG抗体、ALV-p27抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、聚合酶链 反应(PCR)试剂、RT-PCR试剂、生理盐水(0.9%氯化钠)、无水乙醇(分析纯)、丙酮(分析纯)、甘油(分 析纯)、75%酒精、碘酒、细胞生长液(含有5%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基)、细胞维持液 (含有1%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基)、大肠杆菌(TG1)、蛋白酶K、70%冷乙醇、乙酸 钠(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、异戊醇(分析纯)、异丙醇(分析纯)、10×加样缓冲液、琼脂糖、DL2000 DNAMarker、TAE电泳缓冲液、氯化钙(0.1mol/L)、氨苄青霉素(100μg/μL)、双蒸水、LB液体培养 基、TE缓冲液、RNase、细胞裂解液、0.1%的DEPC(焦碳酸乙二酯)水等(除特殊说明外,上述试剂均为 分析纯)。 3.1.2 仪器 锥形瓶、荧光显微镜、恒温培养箱,冰冻台式离心机(≥12000r/min)、-20℃冰箱、-80℃冰箱、 1GB/T26436—2010 Eppendorf管(离心管)、棉棒、载玻片、盖玻片、细胞培养平皿、37℃数显恒温水浴锅、37℃摇床、96孔 培养板、SPF隔离器、紫外光凝胶成像分析仪、微量移液器、低温恒温水槽(16℃)、吸水纸。 3.2 分离病毒用细胞 3.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF) 鸡胚成纤维细胞制备方法见附录A。 3.2.2 鸡胚成纤维细胞自发永生株(DF1)细胞 DF1细胞培养基制备方法见附录B。 3.3 病料的采集与处理 3.3.1 全血、血清或血浆 取疑似病鸡的全血、带有白血细胞的血浆或血清,无菌接种于长成单层的CEF或DF1,置于含5% 二氧化碳的37℃恒温培养箱中培养。 3.3.2 脏器 采集疑似病鸡的脾脏、肝脏、肾脏,按脏器质量的1倍~2倍加入灭菌生理盐水(含青霉素和链霉素 各1000IU/mL)研磨,直至成匀浆液。将悬液移至离心管中充分摇振后,4℃,10000r/min离心 5min,收集上清液。按3.4.1.1中的方法接种培养或-70℃保存备用。 3.3.3 疫苗样品 疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV,应接种DF1细胞或其 他抗E亚群白血病鸡细胞(C/E)鸡来源的细胞。 3.3.4 咽喉、泄殖腔棉拭子 取咽喉棉拭子时,将棉拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次~5次取咽喉分泌液;取泄殖腔棉拭子 时,将棉拭子深入泄殖腔转3圈并沾取少量粪便;将棉拭子头一并放入盛有1.5mL磷酸盐缓冲液的无 菌离心管中(含青霉素和链霉素各1000IU/mL),盖上管盖并编号,10000r/min离心5min后取上清 备用。 3.4 病毒的分离培养与鉴定 3.4.1 病毒的分离培养 3.4.1.1 接种培养:病料接种细胞单层后,置于37℃培养箱中培养2h。然后吸去细胞生长液,换入细 胞维持液,继续培养5d~7d。 3.4.1.2 细胞传代:将3.4.1.1培养的细胞传代于加有盖玻片的平皿中,培养5d~7d。 3.4.2 病毒的鉴定 3.4.2.1 间接免疫荧光抗体反应(IFA) 3.4.2.1.1 固定 将盖玻片上的单层细胞,在自然干燥后滴加丙酮-乙醇(6∶4)混合液室温固定5min,待其自然干 2GB/T26436—2010 燥,用于IFA,或置于-20℃保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。 3.4.2.1.2 加第一抗体 用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)将单克隆抗体(如抗ALV-J亚群特异性单克隆抗体)或抗 ALV单因子鸡血清(抗ALV单因子鸡血清的制备见附录C)稀释到工作浓度,在37℃水浴箱作用 40min,然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。 3.4.2.1.3 加FITC标记二抗 按商品说明书用磷酸盐缓冲液稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体(当第 一抗体为ALV特异性单克隆抗体,选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第二抗体;当第一抗体 为鸡抗ALV单因子血清,则选用FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体作为第二抗体)。37℃水浴箱作用 40min,用磷酸盐缓冲液洗涤3次。 3.4.2.1.4 加甘油 滴加少量50%甘油磷酸盐缓冲液于载玻片上,将盖玻片上的样品倒扣其上。在荧光显微镜下 观察。 3.4.2.1.5 结果观察与判定 被感染的CEF细胞内呈现亮绿色荧光,周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在放大200×~ 400×时,可见被感染细胞胞浆着色,判为ALV阳性,无亮绿色荧光者判为阴性。 3.4.2.2 ALV-p27抗原ELISA检测 3.4.2.2.1 抗原样本制备 将病料同3.4.1.1和3.4.1.2所述方法接种细胞,培养7d~14d后取上清液直接检测;也可取细 胞培养物冻融后检测;或用从泄殖腔采集的棉拭子。 3.4.2.2.2 p27抗原ELISA检测 ALV-p27抗原可用商品试剂盒检测,对不同来源的样品,按厂家的说明书操作。当样本在DF1细 胞或CEF(C/E品系)上检测出ALV-p27抗原时,判为外源性ALV阳性,否则判为阴性。直接用泄殖 腔棉拭子样品检测出p27,说明有ALV,但不能严格区分外源性或内源性。 3.5 ALV亚群鉴定 3.5.1 利用J亚群ALV特异性单克隆抗体进行IFA检测,可以鉴定J亚群ALV,但不能鉴别其他 ALV亚群如A亚群、B亚群、C亚群、D亚群。 3.5.2 对分离到的病毒用RT-PCR(上清液中的游离病毒)或PCR(细胞中的前病毒cDNA)扩增和克 隆囊膜蛋白gp85基因,测序后与基因序列数据库(GeneBank