ICS11.020 C05 中华人民共和国国家标准 GB/T26351—2010 蜚 蠊抗药性检测方法 德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法 Testmethodsofcockroachresistancetoinsecticides— TestmethodsofinsensitiveacetylcholinesteraseforBlattellagermanica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:北京市疾病预防控制中心、中国农业大学、中国人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所。 本标准主要起草人:曾晓芃、高希武、马彦、钱坤、佟颖、梁沛、赵彤言。 ⅠGB/T26351—2010 蜚蠊抗药性检测方法 德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法 1 范围 本标准规定了德国小蠊(Blattellagermanica)体内不敏感乙酰胆碱酯酶(AChE)的检测方法。 本标准适用于德国小蠊对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminatingconcentrationofacetylcholinesterase 能够抑制敏感品系德国小蠊乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度,单位为mol/L或 mmol/L。 2.2 F1代 F1generation 从现场捕捉的德国小蠊,繁殖后得到的第一代。 3 试虫 现场采集德国小蠊,室内饲养,F1代羽化后7d~15d的雄性德国小蠊。冰浴条件下储存不超过 1d,-20℃条件下储存不超过1周或-80℃条件下储存6个月以内。 4 试剂 4.1 磷酸氢二钠(Na2HPO4),化学纯。 4.2 磷酸二氢钾(KH2PO4),化学纯。 4.3 曲拉通X-100(TritonX-100)。 4.4 乙酰硫代胆碱(ATCh),分析纯。 4.5 5,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTNB),分析纯。 4.6 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBS):称取30.18gNa2HPO4·12H2O和2.16gKH2PO4,蒸馏 水定容至1000mL。 4.7 DTNB-乙醇显色剂:称取12.4mgDTNB,溶于125mL95%乙醇中,加入50mL磷酸缓冲液,最 后用蒸馏水定容至250mL,4℃避光保存。 4.8 ATCh溶液:称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,-20℃避光保存。 4.9 ATCh-DTNB混合溶液:称取75mgATCh和13mgDTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。 1GB/T26351—2010 5 分光光度法 5.1 仪器设备 5.1.1 分光光度计。 5.1.2 恒温水浴箱。 5.1.3 玻璃组织匀浆器。 5.1.4 台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。 5.1.5 加液器。 5.2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀 虫药剂对敏感德国小蠊品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A)的2倍,溶剂在反应体系中的最终浓 度应小于1%。 5.3 操作步骤 5.3.1 将单头德国小蠊雄性成虫,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入1mL4℃预冷的磷酸盐缓 冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%TritonX-100),充分匀浆。 5.3.2 匀浆液在4℃,10,000g,离心15min,弃沉淀,取上清即为酶液,冰浴保存备用。 5.3.3 取4支试管,分别加入上述酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加入杀虫药剂水溶液0.1mL, 使其终浓度达到区分浓度,第4支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取1支试管 加入0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。 5.3.4 将上述5支试管于30℃保温5min,再分别加入0.1mL乙酰硫代胆碱(ATCh),30℃继续保 温15min后,加入1.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.3.5 以空白对照调分光光度计0点,于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值 (OD412)。 5.3.6 按上述方法检测100头德国小蠊。 5.4 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(1)。 E=ODt ODc×100% ………………………………(1) 式中: E ———AChE残存活性; ODt———药剂处理管平均光密度值OD412; ODc———无药剂对照管平均光密度值OD412。 5.5 判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE。具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。 2GB/T26351—2010 6 酶标仪法 6.1 仪器设备 6.1.1 酶标仪。 6.1.2 恒温水浴箱。 6.1.3 玻璃组织匀浆器。 6.1.4 台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。 6.1.5 加液器。 6.2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀 虫药剂对敏感德国小蠊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A)的2.5倍,溶剂在反应体系中的最终浓度 应小于1%。 6.3 操作步骤 6.3.1 将单头德国小蠊雄成虫,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入1mL4℃预冷的磷酸盐缓冲 液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%TritonX-100),充分匀浆。 6.3.2 匀浆液在4℃,10000g离心15min,弃沉淀,取上清即为酶液,冰浴保存备用。 6.3.3 在酶标板中的4个孔中分别加入上述酶液0.1mL,在其中3个孔中分别加入一定浓度的杀虫 药剂溶液0.05mL,使其终浓度达到区分浓度,第4个孔中加入0.05mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对 照管,在30℃保温5min后,分别加入0.1mLATCh-DTNB混合溶液,在412nm测定5min时间动 力学曲线,曲线的斜率作为反应初速度(v)。计算平均值。 6.4 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(2)。 E=vt vc×100% …………………………(2) 式中: E ———AChE残存活性; vt———药剂处理组平均反应初速度; vc———无药剂对照组平均反应初速度。 6.5 判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE。具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。GB/T26351—2010 GB/T26351—2010 附 录 A (资料性附录) 常用杀虫药剂对敏感德国小蠊品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 表A.1给出了敌敌畏和残杀威对敏感德国小蠊品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度。 表A.1 常用杀虫药剂对敏感德国小蠊品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 杀虫药剂区分浓度 LC90 mol/L 敌敌畏(DDVP) 0.056×10-4 残杀威(propoxur) 4.69×10-4 注:敏感品系来自北京市疾病预防控制中心医学昆虫饲养室,测定时间为2005年3月。 0102—15362T / BG