ICS11.020 C05 中华人民共和国国家标准 GB/T26349—2010 蝇 类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 Testmethodsofflyresistancetoinsecticides— Testmethodsofinsensitiveacetylcholinesteraseformuscadomestica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的起草规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国农业大学、北京市疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所。 本标准主要起草人:高希武、曾晓芃、梁沛、马彦、刘婷、佟颖、赵彤言。 ⅠGB/T26349—2010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 1 范围 本标准规定了家蝇(Muscadomestica)不敏感乙酰胆碱酯酶(AChE)的检测方法。 本标准适用于家蝇对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminatingconcentrationofacetylcholinesterase 能够抑制敏感品系家蝇乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度,单位为mol/L或 mmol/L。 2.2 F1代 F1generation 从现场捕捉的家蝇,繁殖后得到的第一代。 3 试虫 现场采集家蝇,室内饲养,羽化后3d~5d的F1代雌性家蝇。冰浴条件下储存不超过1d, -20℃条件下储存不超过1周或-80℃条件下储存6个月以内。 4 试剂 4.1 磷酸氢二钠(Na2HPO4),化学纯。 4.2 磷酸二氢钾(KH2PO4),化学纯。 4.3 曲拉通X-100(TritonX-100)。 4.4 乙酰硫代胆碱(ATCh),分析纯。 4.5 5,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTNB),分析纯。 4.6 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBS):称取30.18gNa2HPO4·12H2O和2.16gKH2PO4,蒸馏 水定容至1000mL。 4.7 DTNB-乙醇显色剂:称取12.4mgDTNB,溶于125mL95%乙醇中,加入50mL磷酸缓冲液,最 后用蒸馏水定容至250mL,4℃避光保存。 4.8 ATCh溶液:称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,-20℃避光保存。 5 分光光度法 5.1 仪器设备 5.1.1 分光光度计。 1GB/T26349—2010 5.1.2 恒温水浴箱。 5.1.3 玻璃组织匀浆器。 5.1.4 台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。 5.1.5 加液器。 5.2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX- 100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见表A.1)的2倍,溶剂 在反应体系中的最终浓度应小于1%。 5.3 操作步骤 5.3.1 取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪(切)下,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器(1mL) 中,加入0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100),充分匀浆。 5.3.2 匀浆液在4℃,10000g离心15min,取上清液即为酶液,冰浴保存备用。 5.3.3 取4支试管,分别加入上述酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加入一定量的杀虫药剂溶液 0.1mL,使其终浓度达到区分剂量,第4支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取 1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。 5.3.4 上述5支试管30℃保温5min后,分别加入0.1mLATCh,在30℃继续保温15min后,加入 1.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.3.5 以空白对照调仪器0点,在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的 光密度值(OD412)。 5.3.6 按上述方法每个种群检测100只家蝇。 5.4 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(1): E=ODt ODc×100% …………………………(1) 式中: E ———AChE残存活性; ODt———药剂处理管平均光密度值OD412; ODc———无药剂对照管平均光密度值OD412。 5.5 判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。 6 酶标仪法 6.1 仪器设备 6.1.1 酶标仪。 6.1.2 恒温水浴箱。 6.1.3 玻璃组织匀浆器。 2GB/T26349—2010 6.1.4 台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。 6.1.5 加液器。 6.2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%Triton X-100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见附录A表A.2)的 2.5倍,溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。 6.3 操作步骤 6.3.1 取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪下,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器(1mL)中, 加入0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100),充分匀浆。 6.3.2 匀浆液在4℃,10000g离心15min,取上清液即为酶液,冰浴保存备用。 6.3.3 在酶标板孔中加入0.1mL酶液,在每个孔中分别加入0.05mLDTNB和0.1mL含抑制剂的 ATCh溶液,抑制剂终浓度为区分浓度,每只家蝇设无抑制剂对照一个,用缓冲液代替抑制剂量,在酶标 仪中读数5min,曲线的斜率作为反应初速度(v)。计算平均值。 6.3.4 按上述方法每个种群检测100只家蝇。 6.4 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(2): E=vt vc×100% …………………………(2) 式中: E ———AChE残存活性; vt———药剂处理组平均反应初速度; vc———无药剂对照组平均反应初速度。 6.5 判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。GB/T26349—2010 GB/T26349—2010 附 录 A (资料性附录) 常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 A.1 表A.1给出了用分光光度法测出的3种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度。 表A.1 3种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度(分光光度法) 杀虫药剂区分浓度 I 90 mol/L 敌敌畏(DDVP) 2×10-5 残杀威(propoxur) 4×10-4 灭多威(methomyl) 6×10-5 注:敏感品系来自中国农业大学选育的家蝇敏感品系,2004年测定结果。 A.2 表A.2给出了用酶标仪法测出的3种杀虫剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度。 表A.2 3种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度(酶标仪法) 杀虫药剂区分浓度 I 90 mol/L 敌敌畏(DDVP) 3×10-3 残杀威(propoxur) 5×10-4 灭多威(methomyl) 4×10-2 注:敏感品系来自中国农业大学选育的家蝇敏感品系,2004年测定结果。 0102—94362T / BG