ICS71.040.40;13.060.70 G76 中华人民共和国国家标准 GB/T26322—2010 工 业循环冷却水中亚硝化菌的测定 MPN法 Examinationofnitritebacteriainindustrialcirculatingcoolingwater— MPNtest 2011-01-04发布 2011-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(SAC/TC63/SC5)归口。 本标准负责起草单位:中海油天津化工研究设计院、广州市特种承压设备检测研究院。 本标准主要起草人:张全、李琳、黎华、滕厚开、杜玉辉。 ⅠGB/T26322—2010 工业循环冷却水中亚硝化菌的测定 MPN法 1 范围 本标准规定了工业循环冷却水中亚硝化菌的测定方法。 本标准适用于工业循环冷却水中亚硝化菌的测定,也适用于原水、生活用水及黏泥中亚硝化菌的 测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备(GB/T603—2002,ISO6353-1:1982, NEQ) GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008,ISO3696:1987,MOD) 3 方法提要 在28℃~30℃下,恒温培养试样14d后,先采用格里斯氏(Griess)试剂定性判断亚硝化菌的存 在。如果溶液呈红色,表明为阳性反应;如果溶液未呈红色,表明为阴性反应。再采用MPN技术对被 测试样中的亚硝化菌进行计数。 4 试剂和材料 4.1 本标准所用试剂,除非另有规定,应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定。 试验中所需制剂及制品,在没有注明其他要求时,均按GB/T603之规定制备。 4.2 硫酸铵。 4.3 碳酸钙。 4.4 磷酸二氢钠。 4.5 磷酸氢二钾。 4.6 硫酸锰(MnSO4·4H2O)。 4.7 硫酸镁(MgSO4·7H2O)。 4.8 对氨基苯磺酸。 4.9 α-萘胺。 4.10 盐酸溶液:1+11。 4.11 乙酸溶液(10%)。 4.12 氢氧化钠溶液:40g/L。 4.13 乙醇溶液:体积分数为75%。 4.14 牛皮纸。 1GB/T26322—2010 4.15 医用脱脂纱布。 4.16 医用脱脂棉。 5 仪器、设备 5.1 无菌箱(室)或超净工作台。 5.2 蒸汽压力灭菌器。 5.3 生化培养箱。 5.4 电热干燥箱:温度可控制在60℃~280℃。 5.5 刻度吸管:1mL。 5.6 刻度吸管:10mL。 5.7 试管:d20mm×200mm。 5.8 试管架。 5.9 磨口试剂瓶:1000mL。 5.10 容量瓶:1000mL。 5.11 搪瓷量杯:1000mL。 5.12 白色比色瓷板。 6 试验前准备 6.1 无菌稀释水的制备 6.1.1 生理盐水的配制:称取8.5g氯化钠,溶解在1000mL水中,混匀。 6.1.2 将生理盐水分装在d20mm×200mm的试管中,每管9mL,塞上棉塞,用牛皮纸把试管口包 好,用蒸汽压力灭菌器于(121±1)℃灭菌15min~30min。 6.2 富集培养基的制备 称取下列试剂: 硫酸铵 (NH4)2SO4 2.0g; 磷酸二氢钠NaH2PO4 0.25g; 磷酸氢二钾K2HPO4 0.75g; 碳酸钙 CaCO3 5.0g; 硫酸锰 MnSO4·4H2O0.01g; 硫酸镁 MgSO4·7H2O0.03g。 将上述试剂加水约950mL,在电炉上加热溶解后,趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中。 用热水补充至1000mL,用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0~7.2,并分装在d20mm×200mm的试管 中,每管10mL,塞上棉塞,用牛皮纸把管口包好。十个一捆,用蒸汽压力灭菌器于(121±1)℃灭菌 15min~30min。 6.3 指示剂的制备 格里斯氏(Griess)试剂 A液:对氨基苯磺酸0.5g,乙酸溶液(10%)150mL,保存在棕色瓶中。 B液:α-萘胺0.1g,水20mL,乙酸溶液(10%)150mL,保存在棕色瓶中。 2GB/T26322—2010 6.4 刻度吸管的灭菌 6.4.1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉,棉花量要适宜,长度大约10mm~15mm,棉花 不宜露在口外,多余的棉花可以用火焰烧掉。 6.4.2 每支刻度吸管用一条约40mm~50mm宽的牛皮纸条,以45°左右螺旋形卷起来,吸管的尖部 在头部,粗端将多余的纸条折叠打结,不使散开,标上量度,若干支扎成一束,置电热干燥箱中,于(160± 2)℃灭菌2h。 6.5 采样瓶的灭菌 将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸包好,扎紧,置电热干燥箱中,于 (160±2)℃灭菌2h。 7 测定步骤 7.1 将待测试样放入无菌箱(室)中,立即用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手,点 燃无菌箱(室)内的酒精灯。试样的稀释和接种操作应在无菌箱(室)内的火焰区进行。 7.2 用10倍稀释法稀释试样。即用1mL无菌刻度吸管吸取1mL待测试样注入到9mL无菌稀释 水管中,充分摇匀,此时稀释度为10-1。 7.3 另取一支1mL无菌刻度吸管吸取1mL稀释度为10-1的试样移到第二个无菌稀释水管中,充分 摇匀,此时稀释度为10-2,以此类推,直至需要的稀释度为止。 7.4 将水样(包括稀释水样)分别接种于装有培养基的试管中,试管置试管架上,每个稀释度重复接种 5管(也可根据需要重复接种3管或4管),每管接种1mL,每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。 7.5 另取一组试管培养基不接水样,作为空白。 7.6 培养:在生化培养箱中于28℃~30℃恒温培养14d。 8 计数与报告 8.1 取出少量培养液(约5滴)于白色比色瓷板小窝中,依次加入格里斯氏(Griess)试剂A液和B液各 两滴(格里斯氏试剂A液和B液应按顺序加入)。如果溶液呈红色,则表示有亚硝化菌存在,以“+”(阳 性)表示;如果溶液未呈红色,则表示无亚硝化菌存在,以“-”(阴性)表示。 8.2 如果空白出现阳性反应,说明测定过程中有污染,本次测定无效。 8.3 计算出10进位稀释管中阳性试管数,以阳性组合指数记录下来。 8.4 在10进位稀释中多于3个稀释度时,阳性组合的指数只需要用其中依次的3个稀释度,对这3个 稀释度的选择原则是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度,然后选出其次相连的2个更高的稀释度, 计算出阳性组合指数(见表1中示例1、示例2、示例4)。 8.5 若按照8.4规定的原则选出3个稀释度后,有更高的稀释仍然产生1个阳性试管,就应将这一阳 性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1中示例3)。 8.6 根据阳性组合的指数,查附录A中表A.1得出最大可能菌数(MPN)除以阳性组合指数的第一位 数字的稀释度数,即为每毫升水样中亚硝化菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或者3管,根据阳 性组合的指数查附录B中表B.1或附录C中表C.1)。 3GB/T26322—2010 表1 示例稀释度、生长情况及阳性试管数 10010-110-210-310-4阳性组合指数报告方式 个/mL 1+++++ 5+++++ 5++--- 2----- 0----- 0520 5.0/10-1=50 2+++++ 5++++- 4++--- 2----- 0----- 0542 25/100=25 3+++++ 5+++-- 3+---- 1+---- 1----- 0532 14/100=14 4+++++ 5+++++ 5+++++ 5+---- 1----- 05103.5/10-2= 3.5×102 9 精密度 9.1 由于微生物是不稳定的,精确的试验不能实现,精密度表达仅能按MPN程序。 9.2 在样品中细菌的分布是不规则的,有时细菌成倍地吸附到小颗粒上,MPN正确度随着平行管的 增加而增加,当使用5个平行管时,每管加1mL样品时测定结果的置信度为95%。 4GB/T26322—2010 附 录 A (规范性附录) 五个平行管最大可能的菌数 表A.1规定了五个平行管最大可能的菌数。 表A.1 指数 个/mL 指数 个/mL 指数 个/mL 指数 个/mL 000 0.0 203 1.2 400 1.3 513 8.5 001 0.2 210 0.7 401 1.7 520 5.0 002 0.4 211 0.9 402 2.0 521 7.0 010 0.2 212 1.2 403 2.5 522 9.5 011 0.4 220 0.9 410 1.7 523 12.0 012 0.6 221 1.2 411 2.0 524 15.0 020 0.4 222 1.4 412 2.5 525 17.5 021 0.6 230 1.2 420 2.0 530 8.0 030 0.6 231 1.4 421 2.5 531 11.0 100 0.2 240 1.4 422 3.0 532 14.0 101 0.4 300 0.8 430 2.5 533 17.0 102 0.6 301 1.1 431 3.0 534 20.0 103