ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T25881—2010 牛 胚 胎 Bovineembryo 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A为规范性附录,附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:北京锦绣大地农业股份有限公司、农业部种畜品质监督检验测试中心、北京科润 维德生物技术有限责任公司。 本标准主要起草人:张红霞、郭丽丽、刘艳军、吴亦芳、刘丑生、孙秀柱、张向利、肖静、安晶、孟昭霞、 郭敏、王月、刘佳新、徐敬趁、李继成、王刚、李海洋、沈录智、曹克富、刘颖。 ⅠGB/T25881—2010 牛 胚 胎 1 范围 本标准规定了牛胚胎的生产要求、抽样、检测与判定以及包装、标识、贮存和运输等相关内容的技术 要求。 本标准适用于奶牛、兼用牛、肉牛的胚胎产品。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T2828.1—2003 计数抽样检验程序 第1部分:按接收质量限(AQL)检索的逐批检验抽样 计划 GB/T2828.2—2008 计数抽样检验程序 第2部分:按极限质量(LQ)检索的孤立批检验抽样 方案 GB/T2828.11—2008 计数抽样检验程序 第11部分:小总体声称质量水平的评定程序 GB4143—2008 牛冷冻精液 GB/T5458 液氮生物容器 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 超低温保存 cryopreservation 经特殊方法处理的胚胎放置于-196℃(液氮)的超低温度中,使其新陈代谢暂时停止,从而将胚胎 进行长期保存。 3.2 胚胎解冻 embryothawing 将冷冻保存的胚胎按一定的程序和方法在空气和水浴中融化,并脱除或不脱除冷冻保护剂(如乙二 醇),使胚胎恢复正常的形态和新陈代谢的过程。 3.3 胚胎体外培养 invitroembryoculture 在模拟体内的环境和条件下,胚胎在体外继续发育的过程。 3.4 胚胎移植 embryotransfer 将体内或体外生产的胚胎移植到受体母畜生殖道内,使其继续发育成正常个体的一种繁殖技术。 4 生产要求 4.1 种母牛 应具有种用价值,体质健康,无遗传病,无传染病。 1GB/T25881—2010 4.2 种公牛和精液 种公牛应具有种用价值,体质健康,无遗传病,无传染病,其冷冻精液应符合GB4143—2008的 规定。 4.3 系谱资料 胚胎应具有完整的系谱资料。 4.4 牛胚胎发育阶段划分及编码标准 4.4.1 牛胚胎发育阶段划分见表1。 表1 牛胚胎发育阶段划分 发育阶段 形态描述 早期桑椹胚(5d~6d) 在16细胞~32细胞之间,形似桑椹,体积占透明带内腔50%~60% 致密桑椹胚(6d~7d) 在32细胞~64细胞之间,细胞团变小,界限不明显,体积占透明带内腔60%~70% 早期囊胚(7d~8d) 64细胞及以上,内细胞团的一部分出现发亮的囊胚腔,体积占透明带内腔70%~80%,难 以分清内细胞团和滋养层 囊胚(7d~8d) 内细胞团和滋养层界限清晰,囊胚腔明显,细胞团体积充满透明带内腔 扩张囊胚(8d~9d) 囊胚腔明显扩大,体积增大到原来的1.2倍~1.5倍,与透明带之间无空隙,透明带变薄, 相当于正常厚度的1/3 孵化囊胚(9d~11d) 由于囊胚腔继续扩大,致使透明带破裂,细胞团脱出 4.4.2 胚胎发育阶段编码标准见附录A。 4.5 牛胚胎分级评定 牛胚胎分级评定标准见表2,胚胎分级图片参见附录B。 表2 牛胚胎分级评定标准 质量分级 评定标准 A级 胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,卵裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,胚胎 细胞团呈均匀对称的球形,单个卵裂球(或细胞)的大小、颜色、密度一致,胚胎的发育阶段 与预期的发育阶段一致。透明带光滑,不规则的细胞相对较少,变性细胞不高于10% B级 轮廓清晰,色调及细胞密度良好,胚胎细胞团的大小和形状以及细胞的颜色和密度存在 一定的不规则,有小部分游离细胞,胚胎的发育阶段与预期的发育阶段基本一致,变性细胞 的比例为10%~20% C级 胚胎细胞团的大小和形状以及细胞的颜色和密度存在严重的不规则。轮廓不清晰,色调 发暗,结构较松散,游离的细胞或泡液较多,变性细胞的比例为30%~40% D级 死亡或退化的胚胎,有碎片、轮廓不清晰、结构松散,变性细胞比例高于50% 4.6 胚胎质量要求 胚胎产品冷冻前后的质量均应达到B级(含B级)以上为合格。 4.7 冷冻胚胎细管外观 细管无变形,无裂痕,两端封口严密,标识完整。 5 抽样 5.1 生产方抽样检验 生产方和使用方为质量保证概率把关,按照GB/T2828.2—2008中的第4章,采用极限质量 (LQ=31.5),模式A抽样方案检索一次抽样方案确定抽检牛胚胎的样本量。 2GB/T25881—2010 5.2 质量监督抽样检验 质量监督抽样检验按照GB/T2828.11—2008中的第6章,该群体母牛胚胎为一核查总体,声称质 量水平采用DQL=4,用第O检验水平抽样方案确定抽检母牛(胚胎)的样本量。 5.3 复检和仲裁检验 复检根据原抽样方案确定,仲裁需抽样按照5.2规定的方案和6.6的判定规则。 6 检测与判定 6.1 细管外观 用目测法,其结果应符合4.7中的规定。 6.2 新鲜胚胎 胚胎形态、质量分级评定结果应符合4.5中的规定。 6.3 冷冻胚胎 6.3.1 冷冻胚胎解冻方法 6.3.1.1 器材 恒温水浴锅、实体显微镜。 6.3.1.2 胚胎解冻液 含6%甘油,0.1mol/L蔗糖PBS胚胎解冻液; 含3%甘油,0.1mol/L蔗糖PBS胚胎解冻液; 不含甘油,0.1mol/L蔗糖PBS胚胎解冻液; PBS保存液。 6.3.1.3 方法 6.3.1.3.1 甘油冷冻胚胎解冻 将胚胎细管空气浴10s后置于35℃~37℃水浴中,浸浴至胚胎冷冻细管彻底溶化。 将胚胎依次移入含6%甘油、0.1mol/L蔗糖PBS胚胎解冻液,含3%甘油、0.1mol/L蔗糖胚胎 PBS解冻液,不含甘油、0.1mol/L蔗糖PBS胚胎解冻液中,各停留5min,最后用PBS保存液洗3次, 即可进行镜检。 6.3.1.3.2 乙二醇冷冻胚胎解冻 将胚胎细管空气浴10s后置于35℃~37℃水浴中,浸浴至胚胎冷冻细管彻底溶化,用PBS保存 液洗3次,即可进行镜检。 6.3.2 冷冻胚胎质量评定 胚胎形态、质量分级评定结果应符合4.4及4.5中的规定。 6.4 型式检验 检验项目及标准见4.1~4.7,是在生产方抽样检验、质量监督抽样检验和复检、仲裁检验时所选定 的检验。样品所检验项目中任何一项检验未达到本标准中技术要求的规定,则判为不合格。 6.5 检验项目及检验周期 每生产批入库、出站检验。 6.6 抽样检验对群体质量水平的判定 6.6.1 生产抽样检验的判定 引用GB/T2828.1—2003第3章中Ac为接收数,Re为拒收数,d为不合格品数。 对抽取样本检验,按GB/T2828.2—2008中5.2的规定,当d≤Ac,则判可接收,当d≥Re,则判不 可接收。 6.6.2 质量监督抽样的判定 对抽取样本检验,按GB/T2828.11—2008中6.10的规定,当d<L(不合格品限定数),则抽检样 3GB/T25881—2010 本符合要求,判定核查通过,当d≥L,则抽检样本不符合要求,判核查总体不合格。 7 包装、标识、贮存和运输 7.1 包装与标识 7.1.1 细管材料应无毒、耐低温,细管规格以0.25mL为宜。细管外观应符合4.7的规定。 7.1.2 细管应有明确的标记,注明品种、数量、发育阶段、质量级别、父母品种及注册号、生产日期、生产 单位等,标志上的字迹清晰、完整、准确,并做好存放记录。胚胎发育阶段以编码表示,见附录A的 规定。 7.2 贮存与运输 7.2.1 贮存冻胚和液氮的生物容器,均不可叠放。用液氮生物容器贮存时,细管应完全浸没到液氮中。 液氮容器应符合GB/T5458中的规定。 7.2.2 移动液氮生物容器时,应轻拿轻放,防止冲撞、震动和倾倒。 7.2.3 冻胚运输时,应有专人负责,途中应及时检查和补充冷源(液氮)。运输过程中注意防挤压、防 冻、防雨淋、防晒、通风散热。 4GB/T25881—2010 附 录 A (规范性附录) 胚胎发育阶段编码标准 A.1 导言 本附录给出了不同发育阶段的数字编码。 A.2 原则和方法 对不同发育阶段的胚胎,以阿拉伯数字编码。 示例:胚胎发育在1细胞(1d)时,编码为1。 A.3 编码 不同发育阶段的胚胎编码见表A.1。 表A.1 不同发育阶段的胚胎编码 发育阶段 数字编码 1细胞(1d) 1 2细胞(2d);4细胞(3d);8细胞(4d);16细胞(5d) 2 早期桑椹胚(5d~6d) 3 致密桑椹胚(6d~7d) 4 早期囊胚(7d~8d) 5 囊胚(7d~8d) 6 扩张囊胚(8d~9d) 7 孵化囊胚(9d~11d) 8 5GB/T25881—2010 附 录 B (资料性附录) 胚胎图片 B.1 导言 本附录给出了通用的胚胎形态参考图片。