ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T25879—2010 鸡 蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法 Determinationoflysozymeinchickeneggwhite— Spectrophotometry 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:扬州大学动物科学与技术学院。 本标准主要起草人:王金玉、谢恺舟、戴国俊、侯启瑞、刘大林。 ⅠGB/T25879—2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法。 本标准适用于鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 蛋清 eggwhite 位于鸡蛋蛋壳内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质。 3.2 溶菌酶 lysozyme 一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶。 4 鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的测定 4.1 原理 溶菌酶在281nm波长处有最大吸收峰。溶菌酶标准品用每升溶液含9g氯化钠的溶液溶解并稀 释成不同梯度浓度,在281nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线,求出标准曲线回归方程。试样经过 处理,按溶菌酶标准品测定方法,测定试样中的吸光度,根据其吸光度值由标准曲线回归方程计算试样 中溶菌酶含量。 4.2 仪器 4.2.1 紫外-可见分光光度计(波长范围190nm~900nm,波长确定性±0.3nm,波长重复精度±0.1nm)。 4.2.2 电子分析天平(感量0.1mg、1mg)。 4.2.3 离心机(最大离心力2325g,具10mL离心管)。 4.3 试剂与材料 4.3.1 溶菌酶标准品,优级纯,活力在20000U/mg左右。 4.3.2 氯化钠,分析纯。 4.3.3 蒸馏水,按GB/T6682执行。 4.3.4 医用脱脂纱布。 4.4 试剂配制 4.4.1 0.9%氯化钠溶液:称取氯化钠(4.3.2)0.9g,溶解于蒸馏水中,定容至100mL。 1GB/T25879—2010 4.4.2 溶菌酶标准工作液:称取溶菌酶标准品(4.3.1)0.500g,以0.9%氯化钠溶液(4.4.1)溶解定容 至1000mL,得到500μg/mL的溶菌酶标准工作液,于4℃密封保存备用,1周内使用。 4.5 分析步骤 4.5.1 标准曲线的绘制 分别吸取溶菌酶标准工作液(4.4.2)1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于25mL容量瓶中,以0.9% 氯化钠溶液(4.4.1)稀释至刻度,混匀。用10mm石英比色皿比色,以0.9%氯化钠溶液(4.4.1)为参 比溶液,在波长281nm处依次测定各标准工作液的吸光度,以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标,吸光 度为纵坐标绘制标准曲线,并求出标准曲线回归方程。 4.5.2 试样测定 鸡蛋蛋清用4层纱布过滤,取过滤试样1mL,用0.9%氯化钠溶液稀释定容至100mL,混匀,避免 起泡沫。吸取5mL蛋清的氯化钠溶液,1310g离心5min,取上清液,按照绘制标准曲线的操作步骤 (4.5.1),在波长281nm处测定试样溶液的吸光度。平行测定三次,取结果的算术平均值,由标准曲线 回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度。 4.6 结果的计算与表述 根据试样溶液吸光度值,用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度c。鸡蛋蛋清中溶菌 酶的含量按式(1)计算: X=c×V V1…………………………(1) 式中: X———鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量,单位为微克每毫升(μg/mL); c———试样溶液中溶菌酶的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V———试样溶液定容的体积,单位为毫升(mL); V1———试样的体积,单位为毫升(mL)。 4.7 精密度、准确度、灵敏度 4.7.1 精密度 本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV≤3%,批间变异系数CV≤5%。 4.7.2 准确度 鸡蛋蛋清溶液中添加溶菌酶标准品浓度在20μg/mL~60μg/mL范围内,回收率≥95%。 4.7.3 灵敏度 本方法检测鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶含量的最低检测限为0.3μg/mL。 5 鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定 5.1 原理 溶菌酶通过溶解G+菌的细胞壁使细菌溶解,菌液在可见光范围内的吸光度降低。酶的活力表示 为在特定条件下单位时间内转化底物的速度。本标准根据该原理,以溶壁微球菌为底物,用分光光度 法,以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据,测定溶菌酶的活力。 5.2 仪器 5.2.1 紫外-可见分光光度计(波长范围190nm~900nm,波长确定性±0.3nm,波长重复精度±0.1nm)。 5.2.2 电子分析天平(感量0.1mg、1mg)。 5.2.3 摇床(控温范围0℃~100℃,转速振幅:0r/min~300r/min)。 5.2.4 pH计(精密度±0.01)。 5.2.5 离心机(最大离心力2325g,具10mL离心管)。 2GB/T25879—2010 5.2.6 高压灭菌锅。 5.2.7 超低温冰箱。 5.3 试剂与材料 5.3.1 氯化钠,分析纯。 5.3.2 甘油(丙三醇),分析纯。 5.3.3 磷酸氢二钠,分析纯。 5.3.4 磷酸二氢钠,分析纯。 5.3.5 牛肉膏,生化试剂。 5.3.6 蛋白胨,生化试剂。 5.3.7 酵母提取物,生化试剂。 5.3.8 琼脂,生化试剂。 5.3.9 溶壁微球菌(MicrococcuslysodeikticusFleming)。 5.4 试剂配制与培养基制备 5.4.1 0.9%氯化钠溶液:称取氯化钠0.9g,溶解于蒸馏水中,定容至100mL,121℃高压灭菌 30min。 5.4.2 20%甘油(丙三醇)溶液:称取甘油20.0g,溶解于蒸馏水中,定容至100mL,121℃高压灭菌 30min。 5.4.3 0.2mol/LpH6.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,用蒸馏水溶 解定容至1000mL;称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)33.00g,蒸馏水溶解并定容至1000mL。取 Na2HPO4溶液18.5mL与NaH2PO4溶液81.5mL混合,混匀即可。 5.4.4 固体培养基:牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g溶解于100mL水中,各组分溶解后,加 入琼脂2.0g,持续搅拌至琼脂完全溶解,用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4,并用水定容至 100mL,分装在试管里,每管液量为15mL~20mL,加棉花塞,121℃高压灭菌30min后,倒入培养皿 中加盖,冷却至室温。 5.4.5 液体LB培养基:蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、氯化钠1.0g溶解于100mL水中,用1mol/L 氢氧化钠调整pH至7.2~7.4,分装在试管里,121℃高压蒸汽灭菌30min。 5.5 分析步骤 5.5.1 菌液的制备 将溶壁微球菌(5.3.9)先接种于灭菌的固体培养基(5.4.4)中活化和扩大培养,再接种于灭菌的液 体LB培养基(5.4.5)中,37℃摇床培养至菌体增殖,培养9h~10h,将培养液1310g离心10min,收 集沉淀的菌体。该菌体加入3倍体积灭菌的0.9%氯化钠溶液(5.4.1)悬浮,1310g离心10min,收集 沉淀的菌体,重复4次~5次。再用20%甘油溶液(5.4.2)将菌体制成黏稠状,置于-60℃保存,半年 内使用。 使用前,用磷酸盐缓冲液(5.4.3)溶解溶壁微球菌,调至OD450吸光度值范围在1.2~1.4,2℃~ 8℃放置。 5.5.2 鸡蛋蛋清溶液的制备 鸡蛋蛋清用4层纱布过滤。取过滤试样1mL,用磷酸盐缓冲液(5.4.3)定容至100mL,1310g离 心5min除去不溶物。 5.5.3 试样测定 按4.5的方法,在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度,并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c。 鸡蛋蛋清溶液、菌液于25℃水浴中保温,在450nm波长处测定酶活力,试样测定反应体系见表1。GB/T25879—2010 GB/T25879—2010 表1 试样测定反应体系 加入物 测定液/mL 空白液/mL 鸡蛋蛋清溶液 0.2 0.0 菌液 1.0 0.0 磷酸盐缓冲液(pH6.2) 0.0 1.2 用空白液调零,加0.2mL鸡蛋蛋清溶液到10mm石英比色皿中,从加入1.0mL菌液开始计时, 记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为 A 1、 A 2。按每分钟 OD 450值下降0.001为一个活力 单位(U)的定义,鸡蛋蛋清中溶菌酶的活力按式(2)计算: E A=Δ E 450 0.001× Ew…………………………(2) 式中: E A———鸡蛋蛋清中溶菌酶活力,单位为单位每毫克(U/mg); Δ E 450———在两时间点测定的吸光度 A 1、 A 2之差; E w———0.2mL鸡蛋蛋清溶液中含有溶菌酶的质量,单位为毫克(mg)。 0.2mL鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶的质量 E w与试样溶液中溶菌酶的