ICS65.100 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T25864—2010 球 孢白僵菌粉剂 PowderofBeauveriabassiana 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A、附录B为规范性附录,附录C为资料性附录。 本标准由国家林业局提出并归口。 本标准起草单位:国家林业局森林病虫害防治总站、安徽农业大学、中国林业科学院、华中农业大学 微生物农药国家工程研究中心。 本标准主要起草人:郭志红、李增智、陈昌洁、宋玉双、喻子牛、樊美珍、胡加富、崔永三、苏宏钧、 李林、任浩章。 ⅠGB/T25864—2010 引 言 球孢白僵菌粉剂是一种真菌杀虫剂。白僵菌经过发酵获得分生孢子,经萌发侵入目标害虫体内,破 坏害虫组织并产生毒素,使害虫致死。 球孢白僵菌的名称及基本参数如下: 菌种中文通用名:球孢白僵菌。 菌种拉丁文学名:Beauveriabassiana(Bals.)Vuill. 分类地位:球孢白僵菌在分类上属于真菌门(Eumycota),半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢纲 (Hyphomycetes),丛梗孢目(Moniliales),丛梗孢科(Moniliaceae),白僵菌属(Beauveria)。 鉴定特征:在麦芽浸膏培养基上,菌落的菌丝呈白色绒状,后期呈丛卷毛状至粉状,背面初期无色, 菌落产孢后呈淡黄色至粉红色。分生孢子梗常浓密簇生(但有时单生或轮生),呈瓶状,形成“之”字状弯 曲产孢轴。分生孢子球形,透明,薄壁。大小为(2μm~3μm)×(2μm~2.5μm)。 菌种保藏条件:温度5℃;避光;封装。 有效成分主要存在形式:分生孢子。 生物活性:主要用于防治鳞翅目害虫。 适宜生长条件:麦芽浸粉或PDA培养基、适宜温度25℃、pH6。 最适贮存温度:5℃。 ⅡGB/T25864—2010 球孢白僵菌粉剂 1 范围 本标准规定了球孢白僵菌粉剂的要求、检验方法及标签、包装、贮运等规则。 本标准适用于球孢白僵菌经生物发酵与加工而获得的分生孢子粉剂。 本标准不适用于布氏白僵菌或其他种类白僵菌生产的杀虫剂。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T1605—2001 商品农药采样方法 GB3796—2006 农药包装通则 GB/T16150—1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 球孢白僵菌粉剂 Beauveriapowderproduct 由球孢白僵菌纯菌种经生物发酵生产与加工而获得的分生孢子粉剂。是防治多种害虫的真菌杀 虫剂。 3.2 球孢白僵菌 Beauveriabassiana(Bals.)Vuill. 一种半知菌类的虫生真菌,分类上属于真菌门(Eumycota),半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢 纲(Hyphomycetes),丛梗孢目(Moniliales),丛梗孢科(Moniliaceae),白僵菌属(Beauveria)。 3.3 分生孢子 conidia 一种无性繁殖细胞。着生于分生孢子梗上的瓶状产胞细胞顶端,对昆虫具有致病力。球孢白僵菌 的分生孢子大部分呈球形。 3.4 含孢量 conidiacontent 每克白僵菌粉剂中所含的分生孢子数。 3.5 孢子萌发率 germinationrateofconidia 白僵菌粉剂中所萌发的白僵菌孢子数占孢子总数的百分比。 3.6 毒力测定 bioassay 用杀虫剂感染目标害虫或指示昆虫使其感病死亡,是检验杀虫剂毒力的过程。 1GB/T25864—2010 3.7 毒力 virulence 对目标害虫的致死能力,以通过活体生物测定得到的致死中时LT50表示。 3.8 干燥减量 lossinweight 样品在规定条件下,经加热干燥后质量减少的百分数,即样品中水分及少量低挥发物的量。 3.9 杂菌率 microbialcontaminant 真菌农药中除有效成分真菌外,其他影响有效成分真菌生长的菌占总菌量的百分比。 4 要求 4.1 外观 白色或浅灰白色粉末,不可以有团块。 4.2 控制项目指标 球孢白僵菌粉剂应符合表1的要求。 表1 球孢白僵菌粉剂控制项目指标 项 目 指 标 含孢量高孢粉≥1000亿孢子/g 低孢粉100(±10)亿孢子/g 孢子萌发率高孢粉≥90% 低孢粉≥90% 毒力LT50高孢粉LT50≤5d 低孢粉LT50≤6d 杂菌率高孢粉≤5% 低孢粉≤10% 干燥减量高孢粉≤10% 低孢粉≤10% 细度高孢粉 全部通过160目筛 低孢粉 全部通过35目筛 贮存稳定性 在5℃条件下贮存180d,孢子萌发率大于标明值的80% 5 检验方法 5.1 抽样 按照GB/T1605—2001中5.1.3“商品农药采样方法”进行,用随机数表法确定抽样的包装件,最终 抽样量不少于100g。 5.2 鉴别试验 5.2.1 菌种鉴别 根据所提供的菌种形态学、生物化学、DNA分子特征或国际公认机构的鉴定特征,用显微镜观察法 从生物形态上进行鉴定或采用其他(如生物化学、DNA片段序列)方法进行鉴定。 5.2.2 菌种仲裁鉴定 当对鉴别结果有怀疑或争议时,应到有菌种认证资质的单位,与菌种保藏中心保藏的生产菌株进行 2GB/T25864—2010 对照,由2名以上的专家确定后,出具菌种鉴定报告,作为仲裁依据。 5.3 含孢量的测定 5.3.1 方法提要 本试验采用显微记数法。将粉剂稀释至适当倍数,在显微镜下用血球记数板计孢子数,然后计算含 孢量。 5.3.2 试剂 吐温80(化学纯)。 5.3.3 仪器及设备 光学显微镜、精度为千分之一的天平、组织捣碎机、血球记数板(16×16)、微量移液器、玻璃器皿等。 5.3.4 检验程序 用精度为千分之一的天平准确称取低孢粉1.00g或高孢粉0.10g,装入组织捣碎机的盛液杯中, 同时加入0.1mL的吐温80、200mL清水,以5000r/min的速度搅拌2min,加清水定容至500mL, 再以5000r/min的速度搅拌1min,使之成为均匀的孢子悬浮液。将孢子浓度控制在每中格20~ 40个,如果不合适可以稀释样品调节成此浓度。取深度为0.1mm、血球计数板格为16×16个中格,盖 上配套专用盖玻片,用吸管吸取配制好的悬浮液沿盖玻片的边缘滴入,使孢子液恰好充满盖玻片于载玻 片之间,以孢子液不入槽为度,多余孢子液用滤纸吸去。放在显微镜载物台上静置1min~2min,待浮 动的孢子静止后,放大400倍检视计数。 5.3.5 检验结果计算 血球计数板记数格为16个中格,每个中格为16个小格,则计算双线范围内任一斜对角线上的四个 中格共64个小格的孢子总数。记数时每中格的四周如有压线的孢子,计上线不计下线,计左线不计右 线。按公式(1)计算待测样品的孢子含量: S=(S1+S2+S3+S4)×4×106×T 64……………………(1) 式中: S———含孢量,亿孢子/g; S1~S4———任意4个中格中孢子的数量; T———稀释倍数。 每个样品设3个重复。允许误差率为10%。 5.4 孢子萌发率的测定 将50mL麦芽浸粉培养液(麦芽浸粉2%,用蒸馏水配制)注入预先放入20~30个直径5mm玻璃 珠的250mL三角瓶中,在121℃条件下灭菌20min后,放入待测低孢粉0.2g(或根据含孢量换算成 适合镜检的克数,高孢粉亦然),置于120r/min的摇床上,在25℃条件下培养8h~16h(视菌种特性 而定),取样制片镜检。用血球数板计数,芽管大于孢子半径的孢子计为萌发孢子。按公式(2)计算孢子 萌发率: R=N M×100% …………………………(2) 式中: R———孢子萌发率,%; N———萌发孢子总数; M———检查孢子总数。 每个样品设3个重复。允许误差率为10%。 5.5 干燥减量的测定 5.5.1 仪器及设备 扁形称量瓶(50mm); 3GB/T25864—2010 电热恒温干燥箱(±2℃)。 5.5.2 测定步骤 将扁形称量瓶在110℃干燥箱烘15min,取出称量、记录。准确称取5.00g样品放入皿内,在 (105±2)℃电热恒温干燥箱中烘1h。取出后将样品和扁形称量瓶一起称重,减去扁形称量瓶的重量。 按公式(3)计算干燥减重(含水率): W=5.00-W1 5.00…………………………(3) 式中: W———干燥减重,%; W1———烘干后样品重量,g。 每个样品设3个重复。允许误差率为2%。 5.6 毒力测定 按附录A、附录B进行。 5.7 杂菌率测定(CFU法) 5.7.1 采用2%麦芽浸膏、2%营养琼脂配制培养基,121℃高压灭菌20min后凉至45℃左右,倒入培 养皿制成2mm~4mm的平板。 5.7.2 按5.3.4中的操作步骤称样、均散、稀释(用无菌水)。稀释倍数依具体情况而定,或同时做几个 稀释梯度,使每个培养皿中的菌落保持在10~20个。 5.7.3 用微量移液器接种100μL菌液到培养基平板上,用曲玻棒涂布均匀。做10次重复。 5.7.4 在27℃条件下培养48h,根据菌落特征分辨球孢白僵菌或杂菌,分别计数。计算出杂菌占总菌 落数的百分比。 5