书 书 书犐犆犛 ６７ ． ２２０ ． ２０ 犡 ６０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３５３５ — ２００９ 脂肪酶制剂 犔犻狆犪狊犲狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀狊 ２００９  ０４  ２７ 发布 ２００９  １１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准以 ＱＢ１８０５．４ — １９９３ 《 工业用脂肪酶制剂 》 为基础制定 。 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中国轻工业联合会提出 。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中国食品发酵工业研究院 、 诺维信 （ 中国 ） 生物技术有限公司 。 本标准主要起草人 ： 张蔚 、 郑海峰 、 郭新光 、 唐辰 、 曹振宇 、 康忆隆 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３５３５ — ２００９ 脂肪酶制剂 １ 　 范围 本标准规定了脂肪酶制剂的术语和定义 、 产品分类 、 要求 、 试验方法 、 检验规则和标志 、 包装 、 运输 、 贮存 。 本标准适用于以淀粉质 （ 或糖质 ） 为原料 ， 经微生物发酵 、 提纯制得的中性脂肪酶制剂的生产 、 检验 和销售 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ１９１ 　 包装储运图示标志 （ ＧＢ ／ Ｔ１９１ — ２００８ ， ＩＳＯ７８０ ： １９９７ ， ＭＯＤ ） ＧＢ ／ Ｔ６０１ 　 化学试剂 　 标准滴定溶液的制备 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 　 化学试剂 　 试验方法中所用制剂及制品的制备 （ ＧＢ ／ Ｔ６０３ — ２００２ ， ＩＳＯ６３５３１ ： １９８２ ， ＮＥＱ ） ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 脂肪酶 　 犾犻狆犪狊犲 能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸 ， 将天然油脂水解为脂肪酸及甘油 ， 同 时也能催化酯合成和酯交换反应的酶 。 ３ ． ２ 脂肪酶活力 　 犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犾犻狆犪狊犲 脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示 ， 定义为 １ｇ 固体酶粉 （ 或 １ｍＬ 液体酶 ）， 在一定温度和 ｐＨ 条 件下 ， １ｍｉｎ 水解底物产生 １ μ ｍｏｌ 的可滴定的脂肪酸 ， 即为 １ 个酶活力单位 ， 以 ｕ ／ ｇ （ ｕ ／ ｍＬ ） 表示 。 ４ 　 产品分类 ４ ． １ 　 按产品的应用领域 Ａ 类产品 ——— 食品工业和饲料工业用酶制剂 。 Ｂ 类产品 ——— 其他工业用酶制剂 。 ４ ． ２ 　 按产品形态 固体剂型酶制剂和液体剂型酶制剂 。 ５ 　 要求 ５ ． １ 　 外观 固体剂型 ： 白色至黄褐色粉末或颗粒 ， 无结块 、 无潮解现象 。 无异味 。 有特殊发酵气味 。 液体剂型 ： 浅黄色至棕褐色液体 ， 允许有少量凝聚物 。 无异味 。 有特殊发酵气味 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３５３５ — ２００９ ５ ． ２ 　 理化要求 应符合表 １ 的规定 。 表 １ 　 脂肪酶制剂的理化要求 项 　　 目 固体剂型 液体剂型 酶活力 ａ ／［ ｕ ／ ｍＬ （ 或 ｕ ／ ｇ ）］ ≥ ５０００ 干燥失重 ｂ ／ ％ ≤ ８．０ — 　　 ａ 可按供需双方合同规定的酶活力规格执行 。 ｂ 不适用于颗粒产品 。 ５ ． ３ 　 卫生要求 应符合国家有关规定 。 ６ 　 试验方法 除非另有说明 ， 在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ６ ． １ 　 外观 称取样品 １０ｇ （ 或 １０ｍＬ ）， 观察 、 嗅闻作出判断 ， 做好记录 。 ６ ． ２ 　 酶活力 ６ ． ２ ． １ 　 原理 脂肪酶在一定条件下 ， 能使甘油三酯水解成脂肪酸 、 甘油二酯 、 甘油单酯和甘油 ， 所释放的脂肪酸可 用标准碱溶液进行中和滴定 ， 用 ｐＨ 计或酚酞指示液指示反应终点 ， 根据消耗的碱量 ， 计算其酶活力 。 反应式为 ： ＲＣＯＯＨ＋ＮａＯＨ → ＲＣＯＯＮａ＋Ｈ ２ Ｏ 　　 注 １ ： 酯酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增加 。 蛋白酶的存在会降解脂肪酶 ， 从而使检测到的脂肪酶的活力 减小 。 注 ２ ： 洗涤剂的存在会严重影响本方法 。 依不同洗涤剂的类型和浓度不同 ， 这种影响表现为从完全抑制到激活 。 注 ３ ： 酶会附着在塑料上 ， 因此应用玻璃器皿溶解稀释 ， 同时也应用玻璃器皿滴定 。 在溶液的转移中如果时间很短 ， 且选择适当的塑料材质 ， 可以使用塑料移液枪头 。 ６ ． ２ ． ２ 　 仪器和设备 ６ ． ２ ． ２ ． １ 　 分光光度计 。 ６ ． ２ ． ２ ． ２ 　 恒温水浴 ： 精度 ±０．２℃ 。 ６ ． ２ ． ２ ． ３ 　 自动移液器 。 ６ ． ２ ． ２ ． ４ 　 高速匀浆机 。 ６ ． ２ ． ２ ． ５ 　 ｐＨ 计 ： 精度为 ０．０１ｐＨ 单位 。 ６ ． ２ ． ２ ． ６ 　 电磁搅拌器 。 ６ ． ２ ． ２ ． ７ 　 微量滴定管 ： １０ｍＬ ， 分刻度 ≤ ０．０５ｍＬ 。 ６ ． ２ ． ３ 　 试剂和溶液 ６ ． ２ ． ３ ． １ 　 聚乙烯醇 （ ＰＶＡ ）： 聚合度 １７５０±５０ 。 ６ ． ２ ． ３ ． ２ 　 橄榄油 ： 试验试剂 。 ６ ． ２ ． ３ ． ３ 　 ９５％ （ 体积分数 ） 乙醇 。 ６ ． ２ ． ３ ． ４ 　 底物溶液 ： ——— 称取聚乙烯醇 （ ＰＶＡ ）（ ６．２．３．１ ） ４０ｇ （ 精确至 ０．１ｇ ）， 加水 ８００ｍＬ ， 在沸水浴中加热 ， 搅拌 ， 直 至全部溶解 ， 冷却后定容至 １０００ｍＬ 。 用干净的双层纱布过滤 ， 取滤液备用 。 ——— 量取上述滤液 １５０ｍＬ ， 加橄榄油 ５０ｍＬ ， 用高速匀浆机处理 ６ｍｉｎ （ 分两次处理 ， 间隔 ５ｍｉｎ ， 每 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３５３５ — ２００９ 次处理 ３ｍｉｎ ）， 即得乳白色 ＰＶＡ 乳化液 。 该溶液现用现配 。 ６ ． ２ ． ３ ． ５ 　 磷酸缓冲溶液 （ ｐＨ＝７．５ ）： 分别称取磷酸二氢钾 １．９６ｇ 和十二水磷酸氢二钠 ３９．６２ｇ ， 用水 溶解并定容到 ５００ｍＬ 。 如需要 ， 调节溶液的 ｐＨ 到 ７．５±０．０５ 。 ６ ． ２ ． ３ ． ６ 　 氢氧化钠标准溶液 ［ 犮 （ ＮａＯＨ ） ＝０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ］： 按 ＧＢ ／ Ｔ６０１ 配制与标定 。 使用时 ， 准确稀释 １０ 倍 。 ６ ． ２ ． ３ ． ７ 　 酚酞指示液 （ １０ｇ ／ Ｌ ）： 按 ＧＢ ／ Ｔ６０３ 配制 。 ６ ． ２ ． ４ 　 分析步骤 ６ ． ２ ． ４ ． １ 　 待测酶液的制备 ——— 称取酶样品 １ｇ ～ ２ｇ ， 精确至 ０．０００２ｇ ， 用磷酸缓冲液 （ ６．２．３．５ ） 溶解并稀释 。 如果样品为粉 状 ， 可用少量磷酸缓冲液溶解后用玻璃棒捣研 ， 然后将上清液小心倾入容量瓶中 。 若有剩余残 渣 ， 再加少量磷酸缓冲液充分研磨 ， 最终样品全部移入容量瓶中 ， 用磷酸缓冲液定容至刻度 ， 摇 匀 ， 转入高速匀浆机组织捣碎机捣研 ３ｍｉｎ 后供测定 。 ——— 测定时控制酶液浓度 ， 样品与对照消耗碱量之差控制在 １ｍＬ ～ ２ｍＬ 范围内 。 吸取样品时 ， 应将酶液摇匀后再取 。 ６ ． ２ ． ４ ． ２ 　 测定 ６ ． ２ ． ４ ． ２ ． １ 　 电位滴定法 （ 第一法 ） ａ ） 　 按 ｐＨ 计使用说明书进行仪器校正 ； ｂ ） 　 取两个 １００ｍＬ 烧杯 ， 于空白杯 （ Ａ ） 和样品杯 （ Ｂ ） 中各加入底物溶液 （ ６．２．３．４ ） ４．００ｍＬ 和磷 酸缓冲液 ５．００ｍＬ ， 再于 Ａ 杯中加入 ９５％ 乙醇 （ ６．２．３．３ ） １５．００ｍＬ ， 于 ４０℃±０．２℃ 水浴中 预热 ５ｍｉｎ ， 然后于 Ａ 、 Ｂ 杯中各加待测酶液 １．００ｍＬ ， 立即混匀计时 ， 准确反应 １５ｍｉｎ 后 ， 于 Ｂ 杯中立即补加 ９５％ 乙醇 １５．００ｍＬ 终止反应 ， 取出 ； ｃ ） 　 在烧杯中加入一枚转子 ， 置于电磁搅拌器上 ， 边搅拌 ， 边用氢氧化钠标准溶液 （ ６．２．３．６ ） 滴定 ， 直至 ｐＨ１０．３ ， 为滴定终点 ， 记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积 。 ６ ． ２ ． ４ ． ２ ． ２ 　 指示剂滴定法 （ 第二法 ） ａ ） 　 取两个 １００ｍＬ 三角瓶 ， 分别于空白瓶 （ Ａ ） 和样品瓶 （ Ｂ ） 中各加入底物溶液 ４．００ｍＬ 和磷酸缓 冲液 ５．００ｍＬ ， 再于 Ａ 瓶中加入 ９５％ 乙醇 １５．００ｍＬ ， 于 ４０℃±０．２℃ 水浴中预热 ５ｍｉｎ ， 然 后于 Ａ 、 Ｂ 瓶中各加待测酶液 １．００ｍＬ ， 立即混匀计时 ， 准确反应 １５ｍｉｎ 后 ， 于 Ｂ 瓶中立即补 加 ９５％ 乙醇 １５．０ｍＬ 终止反应 ， 取出 ； ｂ ） 　 于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴 ， 用氢氧化钠标准溶液滴定 ， 直至微红色并保持 ３０ｓ 不褪色为滴定终点 ， 记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积 。 ６ ．