书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０４０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２５０６ — ２００８ 粮油检验 　 酶改性磷脂中 １  和 ２  溶血磷脂酰胆碱的测定 高效液相色谱法 犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犵狉犪犻狀犪狀犱狅犻犾狊 — 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 １ 犪狀犱 ２ 犪犮狔犾 犾狔狊狅狆犺狅狊狆犺犪狋犻犱狔犾犮犺狅犾犻狀犲犻狀犲狀狕狔犿犪狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱狆犺狅狊狆犺狅犾犻狆犻犱狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２００８  １１  ０４ 发布 ２００９  ０１  ２０ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由国家粮食局提出 。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 江南大学 。 本标准主要起草人 ： 王兴国 、 金青哲 、 单良 、 刘元法 、 宋志华 、 潘秋琴 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２５０６ — ２００８ 粮油检验 　 酶改性磷脂中 １  和 ２  溶血磷脂酰胆碱的测定 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定酶改性磷脂中 １ 溶血磷脂酰胆碱 （ １ａｃｌｙｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ ； １ＬＰＣ ） 和 ２ 溶血磷脂酰胆碱 （ ２ａｃｌｙｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ； ２ＬＰＣ ） 的原理 、 试剂 、 仪器设 备 、 样品准备 、 操作步骤 、 结果表示及精密度和准确度 。 本标准适用以大豆磷脂 、 蛋黄磷脂 、 菜籽磷脂为原料制备的溶血磷脂酰胆碱的测定 。 本标准的检出限为 ０．１ μ ｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列标准中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 原理 酶改性磷脂产品中的 １ 和 ２ 溶血磷脂酰胆碱与磷脂酰胆碱 （ ＰＣ ） 等其他成分用高效液相色谱分离 ， 采用示差折光检测器检测 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂 以下所用的试剂 ， 除特殊注明外 ， 均为分析纯试剂 ； 水为符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 ９５％ 乙醇 。 ４ ． ２ 　 草酸 （ Ｈ ２ Ｃ ２ Ｏ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ）。 ４ ． ３ 　 草酸溶液 （ ０．０２ｍｏＬ ／ Ｌ ）： 准确称取 １．２６１ｇ 草酸 （ ４．２ ）， 加水溶解并稀释至 ５００ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 磷脂标准品 １ ） ： 磷脂酰胆碱 （ ＰＣ ）， １ 棕榈酰  溶血磷脂酰胆碱 （ １ＬＰＣ ）， ２ 棕榈酰  溶血磷脂酰胆碱 （ ２ＬＰＣ ）。 １ ） 　 标准品可使用 Ｓｉｇｍａ 公司的产品 。 给出 Ｓｉｇｍａ 公司仅为方便用户使用本标准 ， 并无其他商业行为 ， 其他凡是能 够达到要求的标准品 ， 均可以选择使用 。 ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配折光检测器 。 ５ ． ２ 　 高速离心机 ： １００００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ３ 　 纤维膜 ： ０．４５ μ ｍ 。 ５ ． ４ 　 超声波清洗仪 ： １８０Ｗ 。 ５ ． ５ 　 天平 ： 分度值 ０．０００１ｇ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２５０６ — ２００８ ６ 　 样品准备 称取 ５０ｍｇ ～ １００ｍｇ 酶改性磷脂样品 （ 犿 ）， 用 ９５％ 乙醇溶解稀释至 ２５ｍＬ ， 用高速离心机 （ ５．２ ） 离 心 ， 取上清液用 ０．４５ μ ｍ 纤维膜 （ ５．３ ） 过滤 ， 现配现用 。 ７ 　 操作步骤 ７ ． １ 　 色谱条件 色谱柱 ： 氨基柱 ， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ ， 粒径 ５ μ ｍ ， 或分离效果相当的色谱柱 。 流动相 ： ９５％ 乙醇 （ ４．１ ）： 草酸溶液 （ ４．３ ） ＝９２∶８ （ 体积比 ）， 通过 ０．４５ μ ｍ 纤维膜 （ ５．３ ）， 并经过超 声波 （ ５．４ ） 脱气处理 。 流速 ： １ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 柱温 ： ２５℃ 。 进样量 ： １０ μ Ｌ 。 ７ ． ２ 　 标准曲线 分别精确称取适量预先经五氧化二磷干燥两天的磷脂酰胆碱 、 １ 溶血磷脂酰胆碱 、 ２ 溶血磷脂酰胆 碱标准品 （ ４．４ ）， 用 ９５％ 乙醇 （ ４．１ ） 溶解 、 稀释 ， 配置一系列浓度的标准溶液 ， 标准溶液中各磷脂组分的 浓度在 ０．０５ｍｍｏＬ ／ Ｌ ～ ２．０ｍｍｏＬ ／ Ｌ 范围内 ， 现配现用 。 用微量进样器准确注入 １０ μ Ｌ 现配的各浓度标准溶液于高效液相色谱仪 （ ５．１ ） 中 ， 记录峰面积 ， 以 峰面积对进样量绘制标准曲线 。 标准品的色谱图参见附录 Ａ 。 注 ： 配制好的标准溶液应在 １２ｈ 内完成测定 。 ７ ． ３ 　 色谱测定 用微量进样器准确注入 １０ μ Ｌ 现配的样品液 （ ６ ） 于高效液相色谱仪 （ ５．１ ） 中 ， 按照 （ ７．１ ） 规定的色谱 条件进行色谱分析 ， 记录峰面积 。 样品液中待测组分浓度较高时应进行适当稀释 ， 保证其响应值均在仪 器检测的线性范围内 。 根据保留时间定性 ， 外标法定量 ， 得到样品中 １ 溶血磷脂酰胆碱和 ２ 溶血磷脂 酰胆碱的摩尔浓度 （ 犮 ）。 注 ： 配制好的样品液应在 １２ｈ 内完成测定 。 ８ 　 结果表示 样品中 １ 或 ２ 溶血磷脂酰胆碱的含量按式 （ １ ） 计算 ： 犘 ＝ 犮 × 珨 犕 ｗ × 犞 × ０ ． １ 犿 ……………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犘 ——— 样品中 １ 或 ２ 溶血磷脂酰胆碱的含量 ， 以质量分数计 ， ％ ； 犮 ——— 由外标法测得的样品中 １ 和 ２ 溶血磷脂酰胆碱的浓度 ， 单位为毫摩尔每升 （ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）； 珨 犕 ｗ ——— １ 或 ２ 溶血磷脂酰胆碱摩尔质量的平均值 ， 单位为克每摩尔 （ ｇ ／ ｍｏｌ ）； 犞 ——— 样品最终定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 样品质量 ， 单位为毫克 （ ｍｇ ）。 ９ 　 精密度和准确度 测定值的相对标准偏差小于 ５％ 。 不同浓度水平条件下 ， 方法的回收率为 ９６．７％ ～ １０３．５％ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２５０６ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 磷脂酰胆碱 （ 犘犆 ） 和溶血磷脂酰胆碱 （ 犔犘犆 ） 标准品色谱图 图 犃 ． １ 　 磷脂酰胆碱 （ 犘犆 ） 和溶血磷脂酰胆碱 （ 犔犘犆 ） 标准品色谱图 犌犅 ／ 犜 ２２５０６ — ２００８