书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２４８７ — ２００８ 水产饲料安全性评价 急性毒性试验规程 犘狉犻狀犮犻狆犾犲狅犳犪狇狌犪犳犲犲犱狊犪犳犲狋狔犲狏犪犾狌犪狋犻狅狀 — 犃犮狌狋犲狋狅狓犻犮犻狋狔狋犲狊狋 ２００８  １１  ０４ 发布 ２００９  ０２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准是在参阅了 ＧＢ ／ Ｔ１３２６７ — １９９１ 《 水质 　 物质对淡水鱼 （ 斑马鱼 ） 急性毒性测定方法 》 和 ＧＢ１５１９３．３ — ２００３ 《 急性毒性试验 》 及国内外相关文献的基础上 ， 根据我国技术发展水平研究制定的 。 本标准的附录 Ａ 和附录 Ｂ 为规范性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院饲料研究所 、 国家水产饲料安全评价基地 。 本标准主要起草人 ： 薛敏 、 刘海燕 、 吴秀峰 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２４８７ — ２００８ 水产饲料安全性评价 急性毒性试验规程 １ 　 范围 本标准规定了水产饲料安全性评价急性毒性试验规程的基本技术要求 。 本标准适用于水产饲料原料及水产饲料添加剂的安全性评价 ， 不包括饲料药物添加剂 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ＧＢ１１６０７ 　 渔业水质标准 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 　　 接触致毒法 　 狋狅狌犮犺犻狀犵狋犲狊狋 将受试物按照一定浓度梯度溶解稀释于水 ， 然后放入试验水产动物 。 ３ ． ２ 　　 口服致毒法 　 狅狉犪犾狋犲狊狋 将受试物一次或分次饲喂或灌服给试验动物 。 ３ ． ３ 　　 注射致毒法 　 犻狀犼犲犮狋犻狅狀狋犲狊狋 将受试物配成一定浓度的溶液 ， 按试验动物的体重用注射器直接将一定量的受试物溶液作腹腔或 肌肉注射 。 ３ ． ４ 　　 半数致死浓度 　 犿犲犱犻犪狀犾犲狋犺犪犾犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀 ； 犔犆 ５０ 接触致毒后 ， 引起动物死亡率为 ５０％ 的水体中受试物的浓度 ， 该浓度为经过统计得出的估计值 。 其单位是每升水体中受试物的量 ， 以毫克每升 （ ｍｇ ／ Ｌ ） 或克每升 （ ｇ ／ Ｌ ） 表示 。 ３ ． ５ 　　 半数致死剂量 　 犿犲犱犻犪狀犾犲狋犺犪犾犱狅狊犲 ； 犔犇 ５０ 经口或注射给予受试物后 ， 预期在一定时间内能够引起动物死亡率为 ５０％ 的受试物剂量 。 该剂量 为经过统计得出的估计值 。 其单位是每千克体重所摄入或注射进入的受试物的量 ， 以毫克每千克体重 （ ｍｇ ／ ｋｇ 体重 ）、 克每千克体重 （ ｇ ／ ｋｇ 体重 ） 或毫升每千克体重 （ ｍＬ ／ ｋｇ 体重 ） 表示 。 ３ ． ６ 　　 最大耐受剂量 （ 犕犜犇 ） 法 　 狋犲狊狋狅犳犿犪狓犻犿狌犿狋狅犾犲狉犪狋犲犱犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀 （ 犱狅狊犲 ） 用最大使用浓度和最大口服或注射容量给予至少 １０ 尾试验水产动物后 ， 连续观察 ７ｄ ～ １４ｄ ， 未见 １ 犌犅 ／ 犜 ２２４８７ — ２００８ 任何动物死亡 ， 则 ＭＴＤ 大于该浓度 （ ｍｇ ／ Ｌ ， ｇ ／ ｋｇ 体重 ）。 ３ ． ７ 　　 静水式试验 　 狊狋犪狋犻犮狑犪狋犲狉狋犲狊狋 采用接触致毒法时 ， 试验水产动物所在容器内的试验溶液处于静止状态 ， 试验期间不更换试验溶 液 。 静水式试验只适用于在试验期间稳定而又耗氧不高的受试物 。 ３ ． ８ 　　 换水式试验 　 狊犲犿犻狊狋犪狋犻犮狑犪狋犲狉狋犲狊狋 采用接触致毒法时 ， 每 ２４ｈ 或更短的时间内更换一次同种试验浓度试验液 ， 更换时间根据受试物 的稳定性确定 ， 保证波动范围在初始值的 ２０％ 之内 。 可用于受试物浓度在更换试验液的时间内相对稳 定的试验 。 ３ ． ９ 　　 流水式试验 　 犳犾狅狑狋犺狉狅狌犵犺狋犲狊狋 采用接触致毒法时 ， 试验液连续更新 ， 可用于大多数物质 ， 包括水中不稳定的物质 。 ３ ． １０ 　　 循环水养殖系统 　 狉犲犮犻狉犮狌犾犪狋犻狅狀狊狔狊狋犲犿 养殖用水在系统内经过净化处理后循环使用的养殖系统 。 ３ ． １１ 　　 流水养殖系统 　 犳犾狅狑狋犺狉狅狌犵犺狊狔狊狋犲犿 来自系统外的养殖用水连续或间歇地流经养殖容器的养殖系统 。 ４ 　 原理 通过接触 、 口服或注射对试验动物致毒后 ， 在短时间内观察动物所产生的毒性反应 ， 包括致死的和 非致死的指标参数 ， 通常用半数致死浓度 （ ＬＣ ５０ ） 或半数致死剂量 （ ＬＤ ５０ ） 来表示 。 ５ 　 试验动物 ５ ． １ 　 试验动物的选择 ５ ． １ ． １ 　 选择对受试物敏感的试验水产动物 选取不同分类地位 、 不同食性及不同养殖环境下的 ３ 种以上水产动物各 １０ 尾进行急性毒性试验预 试验 ， 筛选其中对受试物敏感的 １ 种水产动物作为试验动物 。 对于预试验中求不出 ＬＣ ５０ 和 ＬＤ ５０ 的受试 物 ， 可以选择其中任何 １ 种水产动物作为试验动物 。 ５ ． １ ． ２ 　 试验水产动物选用种质纯正 、 规格整齐 、 体格健康的同批苗种 。 正式试验前应有 ７ｄ ～ １５ｄ 的 驯养期 。 ５ ． ２ 　 试验水产动物的饲养管理 试验开始前 ２４ｈ 停止投喂 ， 用于接触致毒试验的水产动物在试验期间停止投饵 ， 用于口服及注射 试验水产动物正常投喂 。 ６ 　 操作步骤 ６ ． １ 　 接触致毒试验 ６ ． １ ． １ 　 制备受试物储备液 配制受试物储备液所用试剂至少为分析纯或给定已知浓度产品 ， 所用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中三级 水的规定 。 将已知量的受试物溶于一定体积的水中 。 储备液应当天配制 。 对于化学性质较稳定的物 质 ， 可配制供 ２ｄ 以上使用的溶液 ， 配好后 ０℃ ～ ４℃ 保存 。 对于那些难溶于水的物质 ， 可采用适当的方 法使其溶解或乳化 ， 如使用超声波 、 有机溶剂 、 乳化剂等 。 有机溶剂在试验溶液中的浓度不应超过 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２４８７ — ２００８ ０．１ｍｇ ／ Ｌ 。 ６ ． １ ． ２ 　 试验溶液的配制 向水中加入适当的受试物储备液 ， 使达到所需要的浓度 。 ６ ． １ ． ３ 　 试验水产动物分组操作 迅速将试验水产动物转移到配制好的不同受试物浓度的养殖容器中 ， 前后不应超过 ３０ｍｉｎ 。 ６ ． ２ 　 口服及注射致毒试验 ６ ． ２ ． １ 　 受试物的处理 受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中 。 一般采用水或食用植物油作介质 ， 可以考虑用羧甲基纤维 素 、 明胶 、 淀粉等配成混悬液 ； 不能配制成混悬液时 ， 可配制成其他形式 （ 如糊状物等 ）。 ６ ． ２ ． ２ 　 受试物的给予 各剂量组的口服或注射容量要相同 （ ｍＬ ／ ｋｇ 体重 ）。 常用注射容量为 １０ｍＬ ／ ｋｇ 体重 。 一般一次性 给予受试物 ， 也可一日内多次给予 （ 每次间隔 ４ｈ ～ ６ｈ ， ２４ｈ 内不超过 ３ 次 ， 合并作为一次剂量计算 ）。 将受试物用于口服的方式可采用自主摄食或人工灌服 ； 而注射的方式可采用腹腔或肌肉注射 ； 将试验水 产动物离水进行灌服或注射操作时一定要使用麻醉剂 （ 见附录 Ａ ）。 ７ 　 试验条件 ７ ． １ 　 试验系统 在接触致毒试验中可采用静水式试验 、 换水式试验或流水式试验 ， 同时保持受试物在水中浓度的稳 定性 ， 并要保证水质指标符合 ＧＢ１１６０７ 的规定 ， 必要时可以采取气泵增氧措施 。 口服或注射致毒试验中可根据试验情况采用静水养殖系统或流水养殖系统 。 ７ ． ２ 　 试验容器 根据受试物性质 ， 针对性地选择无毒 、 对受试物吸附性能低的材料制成的容器 。 受试物为重金属离 子时使用由聚乙烯制成的容器 ； 受试物为有机化合物时使用玻璃 、 玻璃钢容器或搪瓷容器 。 ７ ． ３ 　 试验水温 进行急性毒性试验期间 ， 养殖系统水体温度要保持在试验水产动物生长的适宜温度范围内并相对 恒定 ， 水温温差小于 ±２℃ 。 ７ ． ４ 　 试验周期 ７ ． ４ ． １ 　 接触致毒试验期为 ２４ｈ 、 ４８ｈ 或 ９６ｈ ， 可以观察得出 ２４ｈ 、 ４８ｈ 及 ９６ｈ 的 ＬＣ ５０ 。 ７ ． ４ ． ２ 　 口服或注射致毒试验期为 ７ｄ ～ １４ｄ ， 根据试验水产动物的死亡情况 ， 得出 ＬＤ ５０ 。 ８ 　 几种常用的急性毒性试验设计方法 ８ ． １ 　 寇氏 （ 犓狅狉犫狅狉 ） 法 ８ ． １ ． １ 　 预试验 除另有要求外 ， 应在预试验中求得动物全死亡或 ９０％ 以上死亡的剂量和动物不死亡或 １０％ 以下死 亡的剂量 ， 分别作为正式试验的最高与最低剂量 。 ８ ． １ ． ２ 　 动物数 除另有要求外 ， 设 ５ 个 ～ １０ 个剂量组 ， 每组不少于 ６ 个重复 ， 每