书 书 书犐犆犛 ０７ ． １００ ． ３０ 犆 ５３ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２４２９ — ２００８ 食品中沙门氏菌 、 肠出血性大肠埃希氏菌 犗 １５７ 及 单核细胞增生李斯特氏菌的 快速筛选检验 　 酶联免疫法 犚犪狆犻犱狊犮狉犲犲狀犻狀犵犳狅狉 犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪 ， 犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻 犗 １５７ 犪狀犱 犔犻狊狋犲狉犻犪犿狅狀狅犮狔狋狅犵犲狀犲狊 犻狀犳狅狅犱狊 — 犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅犪狊狊犪狔犿犲狋犺狅犱 ２００８  １０  １９ 发布 ２００９  ０２  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 杭州市质量技术监督检测院 、 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、 上海食品 药品检验所 。 本标准主要起草人 ： 肖海龙 、 顾鸣 、 芮昶 、 韩伟 、 徐伟东 、 鲍英 、 王颖 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２４２９ — ２００８ 食品中沙门氏菌 、 肠出血性大肠埃希氏菌 犗 １５７ 及 单核细胞增生李斯特氏菌的 快速筛选检验 　 酶联免疫法 １ 　 范围 本标准规定了食品中沙门氏菌 、 肠出血性大肠埃希氏菌 Ｏ１５７ 及单核细胞增生李斯特氏菌的酶联 免疫法的检验步骤和判断原则 。 本标准适用于各种食品中沙门氏菌 、 肠出血性大肠埃希氏菌 Ｏ１５７ 及单核细胞增生李斯特氏菌的 定性检验 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．４ 　 食品卫生微生物学检验 　 沙门氏菌检验 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．６ 　 食品卫生微生物学检验 　 致泻大肠埃希氏菌检验 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２８ — ２００３ 　 食品卫生微生物学检验 　 染色法 、 培养基和试剂 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．３０ 　 食品卫生微生物学检验 　 单核细胞增生李斯特氏菌检验 ３ 　 方法提要 样品作增菌处理 ， 增菌液经加热处理后移入包被特异性抗体 （ 一抗 ） 的固相容器内 ， 使目标菌与一抗 结合 ， 洗去未结合的其他成分 ； 加入特异性酶标抗体 （ 二抗 ）， 再次洗去未结合的其他成分 ； 加入特定底物 与之反应 ， 生成荧光化合物或有色化合物 ， 通过检测荧光强度或吸光度 ， 与参照值比较 ， 得出检验结果 。 ４ 　 设备和材料 ４ ． １ 　 酶联免疫分析仪 （ ＶＩＤＡＳ 仪或类似产品 １ ） ）。 　　 １ ） 　 ＶＩＤＡＳ 仪是由法国梅里埃公司提供的产品的商品名 。 给出这一信息是为了方便本标准的使用者 ， 并不表示对 该产品的认可 。 如果其他产品具有相同的效果 ， 则可使用这些等效的产品 。 ４ ． ２ 　 冰箱 ： ２℃ ～ ８℃ 。 ４ ． ３ 　 恒温培养箱 ： ３０℃±１℃ ， ３６℃±１℃ ， ４２℃±１℃ 。 ４ ． ４ 　 均质器 。 ４ ． ５ 　 电子天平 ： 量程 ０ｇ ～ ５００ｇ ， 感量 ０．１ｇ 。 ４ ． ６ 　 旋涡混合器 。 ４ ． ７ 　 恒温水浴锅 。 ４ ． ８ 　 灭菌设备 。 ５ 　 培养基 、 试剂和试剂盒 ５ ． １ 　 缓冲蛋白胨水 （ ＢＰ ）： 按 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２８ — ２００３ 中 ４．１２ 的规定配制 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２４２９ — ２００８ ５ ． ２ 　 氯化镁孔雀绿增菌液 （ ＭＭ ）： 按 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２８ — ２００３ 中 ４．１３ 的规定配制 。 ５ ． ３ 　 四硫磺酸钠煌绿增菌液 （ ＴＴＢ ）： 按 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２８ — ２００３ 中 ４．１４ 的规定配制 。 ５ ． ４ 　 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 （ ＳＣ ）： 按 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．２８ — ２００３ 中 ４．１６ 的规定配制 。 ５ ． ５ 　 改良肠道菌新生霉素增菌液 （ ｍＥＣ＋ｎ ）： 制法参见第 Ａ．１ 章 。 ５ ． ６ 　 Ｆｒａｓｅｒ Ⅰ 增菌液 ： 制法参见 Ａ．２．２．５ 。 ５ ． ７ 　 Ｆｒａｓｅｒ Ⅱ 增菌液 ： 制法参见 Ａ．２．２．６ 。 ５ ． ８ 　 盐酸吖啶黄溶液 ： 制法参见 Ａ．２．２．１ 。 ５ ． ９ 　 萘啶酮酸钠盐溶液 ： 制法参见 Ａ．２．２．２ 。 ５ ． １０ 　 沙门氏菌酶联免疫试剂盒 。 ５ ． １１ 　 肠出血性大肠埃希氏菌 Ｏ１５７ 酶联免疫试剂盒 。 ５ ． １２ 　 单核细胞增生李斯特氏菌酶联免疫试剂盒 。 ６ 　 检验 ６ ． １ 　 沙门氏菌的检验 ６ ． １ ． １ 　 前增菌和增菌 ： 按 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．４ 中的规定处理 。 ６ ． １ ． ２ 　 增菌后处理 ： 移取 １ｍＬ 增菌液到灭菌小试管中 ， 于沸水中加热 １５ｍｉｎ 。 剩余的增菌液于 ４℃ 保存 ， 以便用于阳性确认 。 ６ ． １ ． ３ 　 取沙门氏菌的酶联免疫试剂盒 ， 于 １５℃ ～ ３０℃ 的环境中放置 ３０ｍｉｎ 。 ６ ． １ ． ４ 　 取适量加热处理后的增菌液到试剂盒测试孔中 ， 通过自动或手动操作 ， 经过酶联免疫反应过程 后 ， 检测反应强度 （ 荧光强度或吸光度 ）， 与参照值比较 ， 得出检验结果 。 注 ： 详细操作需根据所用仪器及试剂盒的说明进行 。 ６ ． ２ 　 肠出血性大肠埃希氏菌 犗 １５７ 的检验 ６ ． ２ ． １ 　 增菌 ： 无菌操作取 ２５ｇ （ ｍＬ ） 样品到均质袋中 ， 并向其中加入 ２２５ｍＬｍＥＣ＋ｎ ， 充分均质 ， 于 ４１℃±１℃ 培养 ２４ｈ±１ｈ 。 ６ ． ２ ． ２ 　 增菌后处理 ： 按 ６．１．２ 给出的步骤处理 。 ６ ． ２ ． ３ 　 取肠出血性大肠埃希氏菌 Ｏ１５７ 的酶联免疫试剂盒 ， 于 １５℃ ～ ３０℃ 的环境中放置 ３０ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． ４ 　 检验步骤按 ６．１．４ 给出的步骤处理 。 ６ ． ３ 　 单核细胞增生李斯特氏菌的检验 ６ ． ３ ． １ 　 前增菌 ： 无菌操作取 ２５ｇ （ ｍＬ ） 样品到均质袋中 ， 并向其中加入 ２２５ｍＬＦｒａｓｅｒ Ⅰ 增菌液 ， 充分均 质 ， 于 ３０℃±１℃ 培养 ２４ｈ±１ｈ 。 ６ ． ３ ． ２ 　 增菌 ： 移取 １ｍＬＦｒａｓｅｒ Ⅰ 增菌液 （ ６．３．１ ） 到 ９ｍＬＦｒａｓｅｒ Ⅱ 增菌液中 ， 于 ３０℃±１℃ 培养 ２４ｈ±１ｈ 。 ６ ． ３ ． ３ 　 增菌后处理 ： 按 ６．１．２ 给出的步骤处理 。 ６ ． ３ ． ４ 　 取单核细胞增生李斯特氏菌的酶联免疫试剂盒 ， 于 １５℃ ～ ３０℃ 的环境中放置 ３０ｍｉｎ 。 ６ ． ３ ． ５ 　 检验步骤按 ６．１．４ 给出的步骤处理 。 ７ 　 试剂盒控制 ７ ． １ 　 选用新批号试剂盒时 ， 应验证试剂盒的质量指标 ； 使用时应严格按照试剂盒的要求设立试验对照 。 ７ ． ２ 　 选用试剂盒检验不同目标菌期间 ， 应不定期选用相应的可溯源标准菌株进行过程控制 。 ８ 　 结果报告 检验结果为阴性时 ， 报告为未检出 。 检验结果为阳性时 ， 应按 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．４ 、 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．６ 、 ＧＢ ／ Ｔ４７８９．３０ 或其他标准进行确证 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２４２９ — ２００８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 培 　 养 　 基 犃 ． １ 　 改良肠道菌新生霉素增菌液 （ 犿犈犆 ＋ 狀 ） 犃 ． １ ． １ 　 成分 胰蛋白胨 ２０．０ｇ ３ 号胆盐 １．１２ｇ 乳糖 ５．０ｇ 无水磷酸氢二钾 ４．０ｇ 无水磷酸二氢钾 １．５ｇ 氯化钠 ５．０ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃 ． １ ． ２ 　 制法 将上述成分溶于水后校正 ｐＨ 至 ６．９±１ ， 分装后置 １２１℃ 高压灭菌 １５ｍｉｎ ， 取出后冷却至室温 ， 加 入过滤的新生霉素溶液 ， 使其终浓度为 ２０ｍｇ ／ Ｌ 。 犃 ． ２ 　 犉狉犪狊犲狉 增菌液 犃 ． ２ ． １ 　 成分 酪蛋白酶消化物 ５．０ｇ 动物组织酶消化物 ５．０ｇ 牛肉浸膏 ５．０ｇ 酵母浸膏 ５．０ｇ 氯化钠 ２０．０ｇ 磷酸氢二钠 １２．０ｇ 磷酸氢二钾 １．３５ｇ 七叶苷 １．０ｇ 氯化锂 ３．０ｇ 蒸馏水 １０００ｍＬ 犃 ． ２ ． ２ 　 制法 将上述成分置于 ５０℃ 水浴中充分溶解 ， 冷却后调 ｐＨ 至 ７．０ ～ ７．４ ， 分装 ， １２１℃ 灭菌 １５ｍｉｎ 。 犃 ． ２ ． ２ ． １ 　 盐酸吖啶黄溶液 盐酸吖啶黄 ２５ｍｇ 灭菌蒸馏水 １０ｍＬ 振摇混匀 ， 充分溶解后过滤除菌 ， 避光保存 。 犃 ． ２ ． ２ ． ２ 　 萘啶酮酸钠盐溶液 萘啶酮酸 ２０ｍｇ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ 氢氧化钠溶液 １０ｍＬ 振摇混匀 ， 充分溶解后过滤除菌 。 犃 ． ２ ． ２ ． ３ 　 ０ ． ０５ 犿狅犾 ／ 犔 氢氧化钠溶液 氢氧化钠 ０．１ｇ 犌犅 ／ 犜 ２２４２９ — ２００８ 书书书犌犅／犜２２４２９—２００８ 　　灭菌蒸馏水 ５０ｍＬ 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。 犃．２