书 书 书犐犆犛 ６７ ． １００ 犆 ５３ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２４００ — ２００８ 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 犚犪狆犻犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犲犾犪犿犻狀犲犻狀狉犪狑犿犻犾犽 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犿犲狋犺狅犱 ２００８  １０  １５ 发布 ２００８  １０  １５ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中国计量科学研究院提出 。 本标准由全国仪器分析测试标准化技术委员会归口 。 本标准主要起草单位 ： 中国计量科学研究院 。 本标准参加起草单位 ： 中华人民共和国陕西出入境检验检疫局 、 中国人民解放军总医院 、 北京市产 品质量监督检验所 、 国家地质实验测试中心 、 北京理工大学 、 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、 北京大学 、 北京市营养源研究所 、 军事医学科学院 、 北京科技大学 、 清华大学 。 本标准主要起草人 ： 李红梅 、 张庆合 、 汤桦 、 何雅娟 、 全灿 、 李秀琴 、 黄挺 、 苏福海 、 戴新华 、 马康 、 李晓敏 、 宋德伟 、 徐蓓 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２４００ — ２００８ 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了液相色谱法快速检测原料乳中三聚氰胺的方法 。 本标准适用于原料乳 ， 也适用于不含添加物的液态乳制品 。 本标准定量检测范围为 ０．３０ｍｇ ／ ｋｇ ～ １００．０ｍｇ ／ ｋｇ ， 方法检测限为 ０．０５ｍｇ ／ ｋｇ 。 注 ： 当原料乳中三聚氰胺的含量大于 １００．０ｍｇ ／ ｋｇ 时 ， 具体操作方法见 ６．２．２．３．２ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６３７９．１ 　 测量方法与结果的准确度 （ 正确度与精密度 ） 　 第 １ 部分 ： 总则与定义 （ ＧＢ ／ Ｔ６３７９．１ — ２００４ ， ＩＳＯ５７２５１ ： １９９４ ， ＩＤＴ ） ＧＢ ／ Ｔ６３７９．２ 　 测量方法与结果的准确度 （ 正确度与精密度 ） 　 第 ２ 部分 ： 确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６３７９．２ — ２００４ ， ＩＳＯ５７２５２ ： １９９４ ， ＩＤＴ ） ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 原理 用乙腈作为原料乳中的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺提取剂 ， 强阳离子交换色谱柱分离 ， 高效液相色 谱  紫外检测器或二极管阵列检测器检测 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯或以上规格 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 乙腈 （ ＣＨ ３ ＣＮ ）： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 磷酸 （ Ｈ ３ ＰＯ ４ ）。 ４ ． ３ 　 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ）。 ４ ． ４ 　 三聚氰胺标准物质 （ Ｃ ３ Ｈ ６ Ｎ ６ ）： 纯度大于或等于 ９９％ 。 ４ ． ５ 　 三聚氰胺标准贮备溶液 （ １．００×１０ ３ ｍｇ ／ Ｌ ）： 称取 １００ｍｇ （ 准确至 ０．１ｍｇ ） 三聚氰胺标准物质 ， 用 水完全溶解后 ， １００ｍＬ 容量瓶中定容至刻度 ， 混匀 ， ４℃ 条件下避光保存 ， 有效期为 １ 个月 。 ４ ． ６ 　 标准工作溶液 ： 使用时配制 。 ４ ． ６ ． １ 　 标准溶液 Ａ （ ２．００×１０ ２ ｍｇ ／ Ｌ ）： 准确移取 ２０．０ｍＬ 三聚氰胺标准贮备溶液 （ ４．５ ）， 置于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水稀释至刻度 ， 混匀 。 ４ ． ６ ． ２ 　 标准溶液 Ｂ （ ０．５０ｍｇ ／ Ｌ ）： 准确移取 ０．２５ｍＬ 标准溶液 Ａ （ ４．６．１ ）， 置于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水 稀释至刻度 ， 混匀 。 ４ ． ６ ． ３ 　 按表 １ 分别移取不同体积的标准溶液 Ａ （ ４．６．１ ） 于容量瓶中 ， 用水稀释至刻度 ， 混匀 。 按表 ２ 分 别移取不同体积的标准溶液 Ｂ （ ４．６．２ ） 于容量瓶中 ， 用水稀释至刻度 ， 混匀 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２４００ — ２００８ 表 １ 　 标准工作溶液配制 （ 高浓度 ） 标准溶液 Ａ 体积 ／ ｍＬ ０．１０ ０．２５ １．００ １．２５ ５．００ １２．５ 定容体积 ／ ｍＬ １００ １００ １００ ５０．０ ５０．０ ５０．０ 标准工作溶液浓度 ／（ ｍｇ ／ Ｌ ） ０．２０ ０．５０ ２．００ ５．００ ２０．０ ５０．０ 表 ２ 　 标准工作溶液配制 （ 低浓度 ） 标准溶液 Ｂ 体积 ／ ｍＬ １．００ ２．００ ４．００ ２０．０ ４０．０ 定容体积 ／ ｍＬ １００ １００ １００ １００ １００ 标准工作溶液浓度 ／（ ｍｇ ／ Ｌ ） ０．００５ ０．０１ ０．０２ ０．１０ ０．２０ ４ ． ７ 　 磷酸盐缓冲液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ６．８ｇ （ 准确至 ０．０１ｇ ） 磷酸二氢钾 （ ４．３ ）， 加水 ８００ｍＬ 完全溶 解后 ， 用磷酸 （ ４．２ ） 调节 ｐＨ 至 ３．０ ， 用水稀释至 １Ｌ ， 用滤膜 （ ４．９ ） 过滤后备用 。 ４ ． ８ 　 一次性注射器 ： ２ｍＬ 。 ４ ． ９ 　 滤膜 ： 水相 ， ０．４５ μ ｍ 。 ４ ． １０ 　 针式过滤器 ： 有机相 ， ０．４５ μ ｍ 。 ４ ． １１ 　 具塞刻度试管 ： ５０ｍＬ 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 液相色谱仪 ： 配有紫外检测器或二极管阵列检测器 。 ５ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．０００１ｇ 和 ０．０１ｇ 。 ５ ． ３ 　 ｐＨ 计 ： 测量精度 ±０．０２ 。 ５ ． ４ 　 溶剂过滤器 。 ６ 　 测定步骤 ６ ． １ 　 试样的制备 称取混合均匀的 １５ｇ （ 准确至 ０．０１ｇ ） 原料乳样品 ， 置于 ５０ｍＬ 具塞刻度试管 （ ４．１１ ） 中 ， 加入 ３０ｍＬ 乙腈 （ ４．１ ）， 剧烈振荡 ６ｍｉｎ ， 加水定容至满刻度 ， 充分混匀后静置 ３ｍｉｎ ， 用一次性注射器 （ ４．８ ） 吸取上清液用针式过滤器 （ ４．１０ ） 过滤后 ， 作为高效液相色谱分析用试样 。 ６ ． ２ 　 高效液相色谱测定 ６ ． ２ ． １ 　 色谱条件 ６ ． ２ ． １ ． １ 　 色谱柱 ： 强阳离子交换色谱柱 ， ＳＣＸ ， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ （ 内径 ）， ５ μ ｍ ， 或性能相当者 。 注 ： 宜在色谱柱前加保护柱 （ 或预柱 ）， 以延长色谱柱使用寿命 。 ６ ． ２ ． １ ． ２ 　 流动相 ： 磷酸盐缓冲溶液 （ ４．７ ）  乙腈 （ ７０＋３０ ， 体积比 ）， 混匀 。 ６ ． ２ ． １ ． ３ 　 流速 ： １．５ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 ６ ． ２ ． １ ． ４ 　 柱温 ： 室温 。 ６ ． ２ ． １ ． ５ 　 检测波长 ： ２４０ｎｍ 。 ６ ． ２ ． １ ． ６ 　 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 ６ ． ２ ． ２ 　 液相色谱分析测定 ６ ． ２ ． ２ ． １ 　 仪器的准备 开机 ， 用流动相平衡色谱柱 ， 待基线稳定后开始进样 。 ６ ． ２ ． ２ ． ２ 　 定性分析 依据保留时间一致性进行定性识别的方法 。 根据三聚氰胺标准物质的保留时间 ， 确定样品中三聚 氰胺的色谱峰 （ 参见附录 Ａ ）。 必要时应采用其他方法进一步定性确证 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２４００ — ２００８ ６ ． ２ ． ２ ． ３ 　 定量分析 校准方法为外标法 。 ６ ． ２ ． ２ ． ３ ． １ 　 校准曲线制作 根据检测需要 ， 使用标准工作溶液 （ ４．６．３ ） 分别进样 ， 以标准工作溶液浓度为横坐标 ， 以峰面积为 纵坐标 ， 绘制校准曲线 。 ６ ． ２ ． ２ ． ３ ． ２ 　 试样测定 使用试样 （ ６．１ ） 分别进样 ， 获得目标峰面积 。 根据校准曲线计算被测试样中三聚氰胺的含量 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）。 试样中待测三聚氰胺的响应值均应在方法线性范围内 。 注 ： 当试样中三聚氰胺的响应值超出方法的线性范围的上限时 ， 可减少称样量再进行提取与测定 。 ６ ． ２ ． ３ 　 结果计算 ６ ． ２ ． ３ ． １ 　 计算公式 结果按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ 犮 × 犞 犿 × １０００ １０００ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 原料乳中三聚氰胺的含量 ， 单位为毫克每千克 （ ｍｇ ／ ｋｇ ）； 犮 ——— 从校准曲线得到的三聚氰胺溶液的浓度 ， 单位为毫克每升 （ ｍｇ ／ Ｌ ）； 犞 ——— 试样定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 样品称量质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 ６ ． ２ ． ３ ． ２ 　 计算结果有效数字 通