书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０４０ 犆 ５３ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２２２４４ — ２００８ 保健食品中前花青素的测定 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狆狉狅犮狔犪狀犻犱犻狀狊犻狀犺犲犪犾狋犺犳狅狅犱狊 ２００８  ０７  ３１ 发布 ２００８  １１  ０１ 实施 中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口 。 本标准负责起草单位 ： 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 。 本标准参加起草单位 ： 吉林省疾病预防控制中心 。 本标准主要起草人 ： 杨大进 、 肖晶 、 方从容 、 王竹天 、 刘宏涛 。 本标准为首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２２２４４ — ２００８ 保健食品中前花青素的测定 １ 　 范围 本标准规定了保健食品中前花青素的测定方法 。 本标准适用于以葡萄籽 、 葡萄皮 、 沙棘 、 玫瑰果 、 蓝浆果 、 法国松树皮提取物等为主要原料制造的保 健食品中前花青素的测定 。 本标准的检测限 ： 方法的检出限 （ ＬＯＤ ） 为 １．５×１０ －４ ｇ ／ １００ｇ ， 方法的定量限 （ ＬＯＱ ） 为 ５．０× １０ －４ ｇ ／ １００ｇ 。 方法的线性范围为 １０ μ ｇ ／ ｍＬ ～ １５０ μ ｇ ／ ｍＬ 。 ２ 　 原理 前花青素易溶于水 ， 是黄烷 ３ 苯儿茶酚和表儿茶精连接而成的 。 依据试样中前花青素单体或聚合 物在加热的酸性条件和铁盐催化作用下 ， Ｃ — Ｃ 键断裂而生成深红色花青素离子即氰定的原理 ， 使用高 效液相色谱 ， 经 Ｃ １８ 反相柱分离 ， 在波长 ５２５ｎｍ 处检测 ， 根据保留时间定性 ， 外标法定量 ， 测定试样中前 花青素含量 。 ３ 　 试剂和材料 ３ ． １ 　 甲醇 （ ＣＨ ３ ＯＨ ）： 分析纯 。 ３ ． ２ 　 甲醇 （ ＣＨ ３ ＯＨ ）： 色谱纯 。 ３ ． ３ 　 正丁醇 ［ ＣＨ ３ （ ＣＨ ２ ） ２ ＣＨ ２ ＯＨ ］： 分析纯 。 ３ ． ４ 　 盐酸 （ ＨＣｌ ）： 分析纯 。 ３ ． ５ 　 二氯甲烷 （ ＣＨ ２ Ｃｌ ２ ）： 分析纯 。 ３ ． ６ 　 异丙醇 ［（ ＣＨ ３ ） ２ ＣＨＯＨ ］： 分析纯 。 ３ ． ７ 　 甲酸 （ ＨＣＯＯＨ ）： 分析纯 。 ３ ． ８ 　 硫酸铁铵 ［ ＮＨ ４ Ｆｅ （ ＳＯ ４ ） ２ · １２Ｈ ２ Ｏ ］： 分析纯 。 ３ ． ９ 　 水 （ Ｈ ２ Ｏ ）： 为实验室一级用水 ， 电导率 （ ２５℃ ） 为 ０．０１ｍＳ ／ ｍ 。 ３ ． １０ 　 ２％ 硫酸铁铵 ［ ＮＨ ４ Ｆｅ （ ＳＯ ４ ） ２ · １２Ｈ ２ Ｏ ］ 溶液 ： 称取硫酸铁铵 ２ｇ ， 用浓度为 ２ｍｏｌ ／ Ｌ 盐酸溶解 ， 定 容至 １００ｍＬ 。 ３ ． １１ 　 前花青素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ３ ． １２ 　 前花青素标准溶液 （ １．００ｍｇ ／ ｍＬ ）： 称取 ０．０１ｇ 前花青素标准品 （ 精确至 ０．０００１ｇ ）， 用甲 醇 （ ３．２ ） 溶解并定容至 １０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 此溶液现用现配 。 ４ 　 仪器和设备 ４ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配有紫外检测器 。 ４ ． ２ 　 超声波清洗器 。 ４ ． ３ 　 离心机 ： ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ 　 分析步骤 ５ ． １ 　 试样处理 ５ ． １ ． １ 　 片剂 ： 取 ２０ 片试样 ， 研磨成粉状 。 ５ ． １ ． ２ 　 胶囊 ： 取 ２０ 粒胶囊内容物 ， 混匀 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２２２４４ — ２００８ ５ ． １ ． ３ 　 软胶囊 ： 挤出 ２０ 粒胶囊内容物 ， 搅拌均匀 ， 如内容物含油 ， 应将内容物尽可能挤完全 。 ５ ． １ ． ４ 　 口服液 ： 摇匀后取样 。 ５ ． ２ 　 提取 ５ ． ２ ． １ 　 固体粉状试样 ： 根据试样含量称取 ５０ｍｇ ～ ５００ｍｇ （ 精确至 ０．００１ｇ ） 试样于 ５０ｍＬ 棕色容量瓶 中 ， 加入 ３０ｍＬ 甲醇 （ ３．１ ）， 超声处理 ２０ｍｉｎ ， 放冷至室温后 ， 加甲醇 （ ３．１ ） 至刻度 ， 摇匀 ， 离 心 （ ３０００ｒ ／ ｍｉｎ ， １０ｍｉｎ ） 或放置至澄清后取上清液备用 。 ５ ． ２ ． ２ 　 含油试样 ： 根据试样含量称取 ５０ｍｇ ～ ５００ｍｇ （ 精确至 ０．００１ｇ ） 试样置于小烧杯中 ， 用 ５ｍＬ 二 氯甲烷使试样溶解 ， 并倒入 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 再用甲醇 （ ３．１ ） 多次洗烧杯 ， 并倒入 ５０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用甲醇 （ ３．１ ） 定容至刻度 ， 摇匀 。 ５ ． ２ ． ３ 　 口服液 ： 根据试样含量准确吸取 １ｍＬ ～ ５ｍＬ 样液 ， 置于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 加甲醇 （ ３．１ ） 至刻 度 ， 摇匀 。 ５ ． ３ 　 水解反应 将正丁醇与盐酸按 ９５∶５ 的体积比混合后 ， 取出 １５ｍＬ 置于具塞锥瓶中 ， 再加入 ０．５ｍＬ 硫酸铁铵 溶液和 ２ｍＬ 试样溶液 ， 混匀 ， 置沸水浴回流 ， 精确加热 ４０ｍｉｎ 后 ， 立即置冰水中冷却 ， 经 ０．４５ μ ｍ 滤膜 过滤 ， 待进高效液相色谱分析 。 ５ ． ４ 　 标准曲线制备 吸取标准溶液 （ ３．１２ ） ０．１０ 、 ０．２５ 、 ０．５０ 、 １．０ 、 １．５ｍＬ 置于 １０ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 加甲醇 （ ３．１ ） 至刻 度 ， 摇匀 。 各取 ２ｍＬ 测定 ， 处理方法同 ５．３ ， 以峰高或峰面积对浓度作标准曲线 。 ５ ． ５ 　 液相色谱参考条件 ５ ． ５ ． １ 　 色谱柱 ： 耐低 ｐＨ 型的 ＯＤＳＣ １８ 柱 ， ４．５ｍｍ×１５０ｍｍ ， ５ μ ｍ 。 ５ ． ５ ． ２ 　 柱温 ： ３５℃ 。 ５ ． ５ ． ３ 　 检测器 ： 紫外检测器 。 ５ ． ５ ． ４ 　 检测波长 ： ５２５ｎｍ 。 ５ ． ５ ． ５ 　 流动相 ： 水 ＋ 甲醇 （ ３．２ ） ＋ 异丙醇 ＋ 甲酸 ＝７３＋１３＋６＋８ 。 ５ ． ５ ． ６ 　 进样量 ： １０ μ Ｌ 。 ５ ． ５ ． ７ 　 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ５ ． ８ 　 色谱分析 ： 取标准溶液及试样溶液注入色谱仪中 ， 以保留时间定性 ， 以试样峰高或峰面积与标准 比较定量 。 ５ ． ６ 　 注意事项 实验过程中应避免阳光直射 。 ６ 　 结果计算 试样中前花青素的含量按式 （ １ ） 进行计算 ： 犡 ＝ 犡 １ × 犞 × 犳 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中前花青素的含量 ， 单位为克每千克或克每升 （ ｇ ／ ｋｇ 或 ｇ ／ Ｌ ）； 犡 １ ——— 从标准曲线上得到的含量 ， 单位为毫克每毫升 （ ｍｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 试样定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犳 ——— 稀释倍数 ； 犿 ——— 试样的质量 （ 或体积 ）， 单位为克或毫升 （ ｇ 或 ｍＬ ）。 计算结果保留三位有效数字 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２２２４４ — ２００８ ７ 　 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 １０％ 。 ８ 　 色谱图 在上述色谱条件下的色谱图见图 １ ～ 图 ２ 。 图 １ 　 前花青素标准色谱图 图 ２ 　 前花青素试样色谱图 犌犅 ／ 犜 ２２２４４ — ２００８