书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１９９５ — ２００８ 饲料中硝基咪唑类药物的测定 液相色谱  串联质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狀犻狋狉狅犻犿犻犱犪狕狅犾犲狊犻狀犳犲犲犱狊 — 犔犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狋犪狀犱犲犿犿犪狊狊狊狆犲犮狋狉狅犿犲狋狉狔犿犲狋犺狅犱 ２００８  ０６  １７ 发布 ２００８  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业大学动物医学院 。 本标准主要起草人 ： 沈建忠 、 张素霞 、 程林丽 、 肖希龙 、 李晓薇 、 曹兴元 、 王战辉 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１９９５ — ２００８ 饲料中硝基咪唑类药物的测定 液相色谱  串联质谱法 １ 　 范围 本标准规定了饲料中硝基咪唑类药物含量的液相色谱  串联质谱测定方法 。 本标准适用于配合饲料 、 浓缩饲料和预混合饲料中甲硝唑 、 洛硝哒唑 、 二甲硝唑和替硝唑含量的 测定 。 本标准的检测限 ： 饲料中甲硝唑 、 洛硝哒唑 、 二甲硝唑和替硝唑均为 ８ μ ｇ ／ ｋｇ 。 本标准的定量限 ： 饲料中甲硝唑 、 洛硝哒唑 、 二甲硝唑和替硝唑均为 ２５ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 ３ 　 方法原理 用乙酸乙酯提取试样中的硝基咪唑类药物 ， 浓缩至近干后 ， 溶解于 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸中 ， 经正己烷液 液分配和 ＭＣＸ 固相萃取柱净化 ， 用液相色谱  串联质谱法测定 ， 以色谱保留时间和质谱碎片离子共同 定性 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中规定的二级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ３ 　 乙酸乙酯 。 ４ ． ４ 　 磷酸 。 ４ ． ５ 　 正己烷 。 ４ ． ６ 　 甲酸 ： 色谱纯 。 ４ ． ７ 　 ＭＣＸ 固相萃取柱 ： 规格为 ６０ｍｇ 。 ４ ． ８ 　 微孔滤膜 ： 规格为 ０．２ μ ｍ 。 ４ ． ９ 　 甲硝唑 （ ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ ）： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １０ 　 洛硝哒唑 （ ｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ ）： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １１ 　 二甲硝唑 （ ｄｉｍｅｔｒｉｄａｚｏｌｅ ）： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １２ 　 替硝唑 （ ｔｉｎｉｄａｚｏｌｅ ）： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １３ 　 磷酸溶液 （ ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 取 ３．４ｍＬ 磷酸于 １Ｌ 容量瓶中 ， 用水定容至刻度 ， 混匀 。 ４ ． １４ 　 固相萃取柱淋洗液 ： 氨水 ＋ 水 ＋ 甲醇 ＝０．２＋１０＋０．２ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１９９５ — ２００８ ４ ． １５ 　 固相萃取柱洗脱液 ： 氨水 ＋ 水 ＋ 甲醇 ＝０．２＋２＋８ 。 ４ ． １６ 　 硝基咪唑类药物混合标准贮备液 （ １０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 称取甲硝唑 （ ４．９ ）、 咯硝哒唑 （ ４．１０ ）、 二甲硝唑 （ ４．１１ ） 和替硝唑 （ ４．１２ ） 各 ０．１ｇ （ 精确到 ０．０００１ｇ ） 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈溶解定容 。 －２０℃ 可 保存 ３ 个月 。 ４ ． １７ 　 硝基咪唑类药物混合标准贮备液 （ ２００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 移取 １０００ μ ｇ ／ ｍＬ 硝基咪唑类药物混合标准贮 备液 （ ４．１６ ） １０ｍＬ 于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈稀释定容 。 ４℃ 可保存 １ 个月 。 ４ ． １８ 　 标准工作液 ： 移取适量 ２００ μ ｇ ／ ｍＬ 硝基咪唑类药物混合标准贮备液 （ ４．１７ ）， 用乙腈稀释定容 ， 配 制成 ０．０１ 、 ０．０５ 、 ０．１ 、 ０．５ 、 １ 、 ５ 、 １０ μ ｇ ／ ｍＬ 的标准工作液 。 ４℃ 可保存 １ 周 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 实验室常用仪器 、 设备 。 ５ ． ２ 　 液相色谱  串联质谱联用仪 ： 配电喷雾离子源 。 ５ ． ３ 　 分析天平 ： 感量为 ０．０１ｇ 和 ０．０００１ｇ 。 ５ ． ４ 　 旋涡混合器 。 ５ ． ５ 　 离心机 。 ５ ． ６ 　 振荡器 。 ５ ． ７ 　 旋转蒸发仪 。 ５ ． ８ 　 固相萃取装置 。 ６ 　 采样与试样制备 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 规定采集试样后 ， 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 规定 ， 取有代表性的样品 １ｋｇ ， 四分法缩减 ， 取 约 ２００ｇ ， 经粉碎 ， 全部过 ０．４５ｍｍ 孔筛 ， 混匀装入磨口瓶中备用 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 提取 称取 ２ｇ （ 精确到 ０．０１ｇ ） 试样于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加 １５ｍＬ 乙酸乙酯 ， 涡动 １ｍｉｎ ， ３００ｒ ／ ｍｉｎ 振荡 ３０ｍｉｎ ， ３８００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 取上清液于 １００ｍＬ 鸡心瓶中 ， 下层残渣用 １５ｍＬ 乙酸乙酯重复提 取一次 。 合并两次上清液 ， 为样品提取液 。 ７ ． ２ 　 净化 将样品提取液于 ３５℃ 浓缩至近干 。 加 ３００ μ Ｌ 乙酸乙酯 ， 涡动 １０ｓ ， 再加 ４ｍＬ 正己烷 ， 涡动 ３０ｓ ， 全部转移至 １０ｍＬ 离心管中 。 往鸡心瓶中再加 １．５ｍＬ 磷酸溶液 （ ４．１３ ）， 涡动 １ｍｉｎ ， 全部转移至同一 离心管中 。 加盖密闭 ， 手摇混合 ， ６０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 吸取下层水相于 ５ｍＬ 试管 ， 上层有机相用 １．５ｍＬ 磷酸溶液 （ ４．１３ ） 重复萃取一次 ， 合并两次水相作为固相萃取上样液 。 将 ＭＣＸ 固相萃取柱安装于固相萃取装置上 ， 依次用 ２ｍＬ 乙腈 、 ２ｍＬ 磷酸溶液 （ ４．１３ ） 活化 。 将固 相萃取上样液加载到固相萃取柱上 。 依次用 １ｍＬ 磷酸溶液 （ ４．１３ ）、 ２ｍＬ 固相萃取柱洗涤液 （ ４．１４ ） 淋 洗 ， 抽真空 １ｍｉｎ 。 用 ２ｍＬ 固相萃取柱洗脱液 （ ４．１５ ） 洗脱 。 上样溶液和洗脱液的流速均控制在不超过 １ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 往洗脱液中加 ２０ μ Ｌ 甲酸 ， 混匀 。 ５０℃ 氮气吹干后 ， 用 ２ｍＬ 乙腈复溶 ， 过 ０．２ μ ｍ 滤膜 ， 供 液相色谱  串联质谱仪测定 。 ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ ８ 柱 ， 长 １５０ｍｍ ， 内径 ２．１ｍｍ ， 粒径 ５ μ ｍ ， 或相当者 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１９９５ — ２００８ 流动相 ： 甲醇 ＋ 水 ， 梯度洗脱 ， 梯度洗脱条件见表 １ 。 表 １ 　 梯度洗脱条件 时间 ／ ｍｉｎ 水 ／ ％ 甲醇 ／ ％ ０．０ １００ ０ １２ ３０ ７０ １６ ０ １００ ２５ １００ ０ 　　 流速 ： ０．２ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 柱温 ： 室温 。 进样量 ： １０ μ Ｌ 。 ７ ． ３ ． ２ 　 串联质谱条件 离子化模式 ： 电喷雾电离 ， 正离子扫描 （ ＥＳＩ＋ ）。 离子源喷雾电压 ： ４．５ｋＶ 。 离子源温度 ： ８０℃ 。 脱溶剂温度 ： ３００℃ 。 毛细管电压 ： ３Ｖ 。 碰撞气 ： 氩气 。 监测模式 ： 多反应监测 。 ４ 种硝基咪唑类药物的定性离子对 、 定量离子对 、 锥孔电压和碰撞能量 ， 见表 ２ 。 表 ２ 　 ４ 种硝基咪唑类药物的定性离子对 、 定量离子对 、 锥孔电压和碰撞能量 名 　　 称 定性离子对 （ ｍ ／ ｚ ） 定量离子对 （ ｍ ／ ｚ ） 锥孔电压 ／ Ｖ 碰撞能量 ／ ｅＶ 洛硝哒唑 ２０１ ／ １４０ ２０１ ／ ５５２０１ ／ １４０ １８ １１ ２３ 甲硝唑 １７２ ／ １２８ １７２ ／ ８２１７２ ／ １２８ ２２ １４ ２３ 二甲硝唑 １４２ ／ ９６ １４２ ／ ８１１４２ ／ ９６ ２５ １６ ２５ 替硝唑 ２４８ ／ １２０．７ ２４８ ／ ９２．７２４８ ／ １２０．７ ２０ １７ １７ ７ ． ３ ． ３ 　 液相色谱  串联质谱测定 ７ ． ３ ． ３ ． １ 　 定性测定 根据试样溶液中药物的含量 ， 选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样 。 通过液 相色谱保留时间与质谱选择离子共同定性 。 样品中待测药物与标准物质的保留时间相对偏差不大于 ２．５％ ， 而且其选择离子的相对丰度的差异不大于 １０％ 。 ４ 种药物的标准溶液选择离子色谱图参见