书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３２２ — ２００７ 动物源食品中 ３  甲基喹喔啉  ２  羧酸 残留的测定 　 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳 ３ 犿犲狋犺狔犾狇狌犻狀狅狓犪犾犻狀犲 ２ 犮犪狉犫狅狓狔犾犻犮犪犮犻犱狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犪狀犻犿犪犾 狅狉犻犵犻狀犳狅狅犱 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 华中农业大学 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 袁宗辉 、 吴玉杰 、 陶燕飞 、 王玉莲 、 黄玲利 、 陈冬梅 、 彭涛 、 刘振利 、 彭大鹏 、 戴梦红 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３２２ — ２００７ 动物源食品中 ３  甲基喹喔啉  ２  羧酸 残留的测定 　 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了猪 、 鸡 、 鱼可食性组织中 ３ 甲基喹喔啉 ２ 羧酸 （ ３ｍｅｔｈｙｌｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ２ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ， ＭＱＣＡ ） 残留检测的制样和高效液相色谱的测定方法 。 本标准适用于猪 、 鸡肌肉 、 肝脏和鱼肌肉中 ＭＱＣＡ 残留的定量检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 肌肉或肝脏组织样在酸性溶液中水解 ， 然后经乙酸乙酯提取 ， 磷酸盐缓冲溶液反萃取 ， 用混合阴离 子 ＳＰＥ 柱净化后 ， 高效液相色谱法 （ 紫外检测器 ） 测定 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 乙酸乙酯 。 ４ ． ３ 　 偏磷酸 ： 优级纯 。 ４ ． ４ 　 磷酸 ： 优级纯 。 ４ ． ５ 　 甲酸 ： 优级纯 。 ４ ． ６ 　 磷酸氢二钾 。 ４ ． ７ 　 偏磷酸甲醇溶液 ： 准确称取偏磷酸 ５０．０ｇ ， 加入水 ， 加热至溶解 ， 冷却后加入甲醇 ２００ｍＬ ， 加水定 容至 １０００ｍＬ ， 混匀 ， 常温保存 ， 有效期 １ 个月 。 ４ ． ８ 　 氢氧化钠溶液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 准确称取氢氧化钠 ０．５ｇ ， 用蒸馏水溶解 ， 冷却后定容至 ２５０ｍＬ ， 常 温保存 ， 有效期 ３ 个月 。 ４ ． ９ 　 甲酸  甲醇溶液 ： 准确量取甲酸 １ｍＬ 于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 加甲醇 ， 稀释并定容至 ５０ｍＬ ， 混匀 ， 现 配现用 。 ４ ． １０ 　 磷酸缓冲液 （ ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 准确称取磷酸氢二钾 （ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ · ３Ｈ ２ Ｏ ） ２．２８ｇ ， 加 ９００ｍＬ 水溶解 ， 磷酸调 ｐＨ 值至 ７．０ ， 加水定容至 １０００ｍＬ ， 常温保存 ， 有效期 １ 个月 。 ４ ． １１ 　 标准品 ： ３ 甲基喹喔啉 ２ 羧酸 ， 含量高于 ９８％ 。 ４ ． １２ 　 标准贮备液 ： 准确称取 ＭＱＣＡ１０．０ｍｇ ， 用甲醇配成浓度为 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 的标准贮备液 ， ４℃ 避光 保存 ， 有效期 ６ 个月 。 ４ ． １３ 　 固相萃取小柱 ＭＡＸ 柱 （ 混合阴离子交换柱 ）： 规格 ６０ｍｇ ， ３ｍＬ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３２２ — ２００７ ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配紫外检测器 。 ５ ． ２ 　 高速离心机 。 ５ ． ３ 　 高速组织捣碎机 。 ５ ． ４ 　 涡旋混合器 。 ５ ． ５ 　 真空泵 。 ５ ． ６ 　 固相萃取装置 。 ５ ． ７ 　 移液器 ： １ｍＬ ～ ５ｍＬ ， １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ５ ． ８ 　 ｐＨ 计 。 ６ 　 试样制备与保存 ６ ． １ 　 试样的制备 取新鲜猪或鸡的肌肉 、 肝脏或鱼肌肉组织 ， 绞碎并均质 。 ６ ． ２ 　 试样的保存 －２０℃ 以下贮存 。 　　 注 ： 在制样的操作过程中 ， 应防止样品污染或残留物含量发生变化 。 ７ 　 样品处理 ７ ． １ 　 提取 准确称取新鲜或解冻后的试样 ５．００ｇ 置于离心管中 ， 加偏磷酸甲醇溶液 ８ｍＬ ， 旋涡混合 ２ｍｉｎ ， ６０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ ， 取出上清液 ， 在残渣中再加入偏磷酸甲醇溶液 ８ｍＬ 重复提取一次 ， 合并 ２ 次 上清液 。 于上清液中加乙酸乙酯 ８ｍＬ ， 旋涡混合 １ｍｉｎ ， ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取有机相层 ， 再加乙 酸乙酯 ８ｍＬ 重复提取 ， 合并 ２ 次有机相 。 有机相中 ， 加磷酸盐缓冲液 ６ｍＬ ， 旋涡混和 １ｍｉｎ ， 放置 １０ｍｉｎ ， 收集下层水相 ， 另用磷酸盐缓冲液 ６ｍＬ 再反萃取有机相一次 ， 合并 ２ 次水相待净化 。 ７ ． ２ 　 净化 ＭＡＸ 柱依次用甲醇 ３ｍＬ 、 水 ３ｍＬ 活化 ， 加 ７．１ 样品提取液至 ＭＡＸ 柱中 ， 控制流速小于 １ｍＬ ／ ｍｉｎ ， 先后用 ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ 氢氧化钠溶液 ３ｍＬ 、 甲醇 ３ｍＬ 淋洗 ， 抽干 ， ２％ 甲酸  甲醇溶液 ３ｍＬ 洗 脱 ， ４０℃ 以下氮吹至近干 ， 加甲醇 ０．５ｍＬ 溶解残渣 ， 旋涡混匀 ， 待测 。 ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ ， ２５０ｍｍ×４．６ｍｍ （ 内径 ）， 粒径 ５ μ ｍ ， 或相当者 ； 流动相 ： １％ 甲酸水溶液 ＋ 乙腈 （ ８０＋２０ ）； 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ ； 紫外检测器波长 ： ３２０ｎｍ ； 进样量 ： ２０ μ Ｌ ； 柱温 ： ３０℃ 。 ７ ． ３ ． ２ 　 液相色谱测定 取试样溶液和标准工作液 ， 作单点或多点校准 ， 以色谱峰面积定量 ， 标准工作液及试样液中的 ＭＱＣＡ 响应值均应在仪器检测的线性范围内 。 在上述色谱条件下 ， ＭＱＣＡ 保留时间在 ９．０ｍｉｎ 左右 ， 标准溶液和试样溶液的液相色谱图参见附录 Ａ 。 ７ ． ４ 　 标准曲线的制备 准备移取 ＭＱＣＡ 标准贮备液适量 ， 用甲醇依次稀释成浓度分别为 ２５ μ ｇ ／ Ｌ 、 ５０ μ ｇ ／ Ｌ 、 １００ μ ｇ ／ Ｌ 、 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３２２ — ２００７ ２５０ μ ｇ ／ Ｌ 、 ５００ μ ｇ ／ Ｌ 、 １０００ μ ｇ ／ Ｌ 的标准工作液 。 每个浓度重复 ３ 次 ， 将测得的峰面积与相对应浓度绘 制标准曲线 ， 拟合 ， 求回归方程和相关系数 。 ７ ． ５ 　 空白实验 对于除不添加标准品工作液外的阴性样品采用完全相同的步骤进行操作 。 ８ 　 结果计算 残留量按式 （ １ ） 进行计算 ： 犡 ＝ 犚 × 犮 × 犞 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中分析物的含量 ， 单位为微克每千克 （ μ ｇ ／ ｋｇ ）； 犚 ——— 样液中的分析物与内标物峰面积比值 ； 犮 ——— 混合基质标准溶液中分析物的浓度 ， 单位为纳克每毫升 （ ｎｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 样液最终定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 试样的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 　　 注 ： 计算结果需将空白值扣除 。 ９ 　 测定低限 （ 犔犗犙 ） 在猪 、 鸡 、 鱼肌肉中的测定低限均为 ４ μ ｇ ／ ｋｇ ； 猪 、 鸡肝脏中的测定低限均为 １０ μ ｇ ／ ｋｇ 。 １０ 　 回收率和精密度 参见表 Ｂ．１ ～ 表 Ｂ．６ 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ２１３２２ — ２００７ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 标准样品高效液相色谱图 图 犃 ． １ 　 犕犙犆犃 标准溶液浓度为 ５０ μ 犵 ／ 犔 的色谱图 在选定条件下 ， ＭＱＣＡ 的保留时间为 ８．８ｍｉｎ 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ２１３２２ — ２００７ 附 　 录 　 犅 （ 资料性附录 ） 添加回收率 表 犅 ． １ 　 喹乙醇代谢物 犕犙犆犃 在猪肌肉组织中的回收率 添加浓度 ／（ μ ｇ ／ ｋｇ ） 回收率 ／ ％ 批次 １ 批次 ２ 批次 ３ 批次 ４ 批次 ５ 平均值 （ 狀 ＝２５ ） ４ ８１．３ ６８．５ ７４．９ ６４．８ ７７．２ ７３．４ ７５．９ ７８．２ ７８．８ ７９．１ ８５．３ ８７．５ ８９．４ ８１．５ ７５．５ ７９．４ ８５．３ ８８．６ ７０．９ ７５．８ ６８．５ ８２．４ ８１．２ ８０．３ ７８．６ ７８．４±８．９ ８ ７６．３ ７５．２ ８４．５ ８