书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３２０ — ２００７ 动物源食品中阿维菌素类药物残留量 的测定 　 液相色谱  串联质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪狏犲狉犿犲犮狋犻狀狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 — 犔犆犕犛 ／ 犕犛 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业大学 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 沈建忠 、 丁双阳 、 李晓薇 、 夏曦 、 张素霞 、 江海洋 、 程林丽 、 曹兴元 、 彭涛 、 国伟 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３２０ — ２００７ 动物源食品中阿维菌素类药物残留量 的测定 　 液相色谱  串联质谱法 １ 　 范围 本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量的液相色谱  串联质谱检测法 。 本标准适用于牛肝脏和牛肌肉中埃普利诺菌素 、 阿维菌素 、 多拉菌素和伊维菌素残留量的测定 。 本标准的方法检测限 ： 埃普利诺菌素 、 阿维菌素 、 多拉菌素和伊维菌素均为 １．５ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 用乙腈提取试样中的 ４ 种阿维菌素类药物 ， 经 Ｃ １８ 固相萃取柱和 Ｃ ８ 固相萃取柱净化后 ， 用液相色 谱  串联质谱法测定 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 三乙胺 。 ４ ． ３ 　 甲酸 ： 色谱纯 。 ４ ． ４ 　 埃普利诺菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． ５ 　 阿维菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． ６ 　 多拉菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９４．３％ 。 ４ ． ７ 　 伊维菌素标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． ８ 　 Ｃ １８ 固相萃取柱 ： ５００ｍｇ ， ３ｍＬ 。 ４ ． ９ 　 Ｃ ８ 固相萃取柱 ： ５００ｍｇ ， １０ｍＬ 。 ４ ． １０ 　 样品稀释液 ： 水 ＋ 三乙胺 （ ３０＋０．０４５ ， 体积比 ）。 ４ ． １１ 　 Ｃ １８ 固相萃取柱洗涤液 ： 乙腈 ＋ 水 ＋ 三乙胺 （ ４０＋６０＋０．１ ， 体积比 ）。 ４ ． １２ 　 Ｃ ８ 固相萃取柱洗涤液 ： 乙腈 ＋ 水 ＋ 三乙胺 （ ３０＋７０＋０．１ ， 体积比 ）。 ４ ． １３ 　 埃普利诺菌素 、 阿维菌素 、 多拉菌素和伊维菌素标准储备液 ： １００ μ ｇ ／ ｍＬ 。 分别准确称取 ０．０１０ｇ 埃普利诺菌素 、 阿维菌素 、 多拉菌素和伊维菌素标准品 （ ４．４ ～ ４．７ ） 于四个 １００ｍＬ 容量瓶 ， 用乙腈溶解 稀释至刻度 。 －２０℃ 保存六个月 。 ４ ． １４ 　 混合标准储备液 ： １ μ ｇ ／ ｍＬ 。 取四种标准储备液 （ ４．１３ ） 各 １．０ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙腈 稀释至刻度 ， ４℃ 保存三个月 。 ４ ． １５ 　 标准工作液 ： 分别量取适量上述混合标准储备液 （ ４．１４ ）， 用乙腈稀释成浓度为 １ 、 ５ 、 １０ 、 ２０ 、 ５０ 、 １００ 和 ２００ｎｇ ／ ｍＬ 的系列标准工作液 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３２０ — ２００７ ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 液相色谱  串联四级杆质谱仪 ： 配有电喷雾电离源 （ ｅｌｅｃｔｒａｙｓｐｒａｙｉｏｎｏｚｉｔｉｏｎ ， ＥＳＩ ）。 ５ ． ２ 　 离心机 。 ５ ． ３ 　 振荡器 。 ５ ． ４ 　 涡动仪 。 ５ ． ５ 　 氮吹仪 。 ５ ． ６ 　 组织匀浆机 。 ６ 　 试样制备与保存 取新鲜或解冻的动物组织 ， 剪碎 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 匀浆 １ｍｉｎ 。 －２０℃ 下保存 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 提取 称取试样 ２．５ｇ （ 精确到 ０．０１ｇ ）， 于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加 ８ｍＬ 乙腈 ， 涡动 ０．５ｍｉｎ ， ２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离 心 ２ｍｉｎ ， 取上清液 。 残渣用 ８ｍＬ 乙腈重复提取一次 ， 合并两次上清液 。 加 ３０ｍＬ 样品稀释液 （ ４．１０ ）， 涡动混合均匀 ， 为样品提取液 ， 备用 。 ７ ． ２ 　 净化 取 Ｃ １８ 固相萃取柱 ， 依次用 ５ｍＬ 乙腈 、 ５ｍＬＣ １８ 固相萃取柱洗涤液 （ ４．１１ ） 活化 。 将备用的样品提 取液 （ ７．１ ） 过柱 。 用 ２０ｍＬＣ １８ 固相萃取柱洗涤液 （ ４．１１ ） 淋洗 ， 抽干 ； 再用 ３ｍＬ 正己烷淋洗 ， 抽干 。 ２ｍＬ 乙腈洗脱 ， 收集 。 加入 ４ｍＬ 样品稀释液 （ ４．１０ ）， 混合均匀 ， 备用 。 取 Ｃ ８ 固相萃取柱 ， 依次用 ５ｍＬ 乙腈和 Ｃ ８ 固相萃取柱洗涤液 （ ４．１２ ） 平衡 ， 取备用液过柱 。 用 １０ｍＬＣ ８ 固相萃取柱洗涤液 （ ４．１２ ） 淋洗 ， 挤干 ； 再用 ８ｍＬ 正己烷淋洗 ， 挤干 ； 用 ２ｍＬ 乙腈洗脱 ， 收集 洗脱液 。 于 ５０℃ 下氮气吹干 ， 加 ０．５ｍＬ 乙腈溶解 。 过 ０．２ μ ｍ 滤膜 ， 进样分析 。 注 ： 上样溶液 、 淋洗液和洗脱液的流速均控制不超过 １ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 ７ ． ３ 　 基质添加标准工作液的制备 取空白试样按提取 （ ７．１ ） 与净化 （ ７．２ ） 进行处理 ， 在洗脱液中加入 ０．５ｍＬ 相应浓度的标准工作液 （ ４．１５ ）， 氮吹 、 定容后作为基质添加标准工作液 ， 供液相色谱  串联质谱仪测定 。 ７ ． ４ 　 测定 ７ ． ４ ． １ 　 液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ ， １５０ｍｍ×２．１ｍｍ ， 粒径 ３ μ ｍ ， 或相当者 。 流动相 ： 乙腈 ＋ 水 ＋ 甲酸 （ ９５＋５＋０．１ ， 体积比 ）。 流速 ： ０．２ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 柱温 ： 室温 。 进样量 ： １０ μ Ｌ 。 ７ ． ４ ． ２ 　 质谱参考条件 离子化方式 ： 电喷雾离子源 ， 正离子扫描 （ ＥＳＩ＋ ）。 毛细管电压 ： ３．２ｋＶ 。 离子源温度 ： １２０℃ 。 雾化气 ： ３００℃ 。 倍增器电压 ： ６５０Ｖ 。 碰撞气 ： 氩气 。 其他参数见表 １ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３２０ — ２００７ 表 １ 　 质谱参数设置 药物母离子 （ ｍ ／ ｚ ） 子离子 （ ｍ ／ ｚ ） 驻留时间 ／ ｓ 碰撞能量 ／ ｅＶ 锥孔电压 ／ Ｖ 埃普利诺菌素 ９３６．６３５２．０ ａ ４９０．０ ０．４ ２８ ７５ 阿维菌素 ８９５．６３２７．４ ａ ４４９．３ ０．４ ２５ ７０ 多拉菌素 ９２１．５３５３．２ ａ ４４９．０ ０．４ ２８ ８０ 伊维菌素 ８９７．５３２９．１ ａ ７５３．３ ０．４ ２５ ７０ 　　 ａ 　 定量离子 。 ７ ． ４ ． ３ 　 液相色谱  串联质谱测定 根据样品溶液中药物的残留量 ， 选择峰面积相近的标准工作液作为随行标样 。 对标准工作液和样 品溶液等体积参插进样进行测定 。 ４ 种药物的离子色谱图见附录 Ａ 。 ７ ． ４ ． ３ ． １ 　 定性测定 通过液相色谱保留时间与串联质谱选择离子共同定性 。 待测样品的保留时间与外标标准样品保留 时间的相对偏差不大于 ２．５％ 。 且与外标标准品相比 ， 样品中待测组分两个定性子离子的相对丰度比 不大于 １０％ 。 ７ ． ４ ． ３ ． ２ 　 定量测定 分别取适量试样溶液和相应浓度的基质添加标准工作液 ， 作单点校准 ， 以色谱峰面积积分值定量 。 标准工作液及试样液中阿维菌素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内 ， 试样液进样测定过 程中应参插标准工作液 ， 以便准确定量 。 标准溶液离子色谱图见附录 Ａ 。 ８ 　 结果计算与表达 按式 （ １ ） 计算试样中阿维菌素类药物的残留量 。 犡 ＝ 犃 ｘ × 犞 × 犮 ｓ 犃 ｓ × 犿 ……………………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中药物的残留量 ， 单位为微克每千克 （ μ ｇ ／ ｋｇ ）； 犃 ｘ ——— 试样特征离子峰面积 ； 犞 ——— 试样溶液最终定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犮 ｓ ——— 基质标准溶液浓度 ， 单位为微克每升 （ μ ｇ ／ Ｌ ）； 犃 ｓ ——— 基质标准溶液特征离子峰面积 ； 犿 ——— 试样质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 注 ： 计算结果需扣除空白值 ， 测定结果用平行测定的算术平均值表示 ， 保留至小数点后 ２ 位 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ２１３２０