书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１３１８ — ２００７ 动物源食品中硝基咪唑残留量 检验方法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狀犻狋狉狅犻犿犻犱犪狕狅犾犲狊狉犲狊犻犱狌犲狊 犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀 ２００７  １０  ２９ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 、 附录 Ｂ 、 附录 Ｃ 、 附录 Ｄ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫 局 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 荣会 、 牟峻 、 张代辉 、 林黎明 、 张鸿伟 、 马书民 、 赵庆松 、 李晓娟 、 彭涛 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１３１８ — ２００７ 引 　　 言 　　 硝基咪唑类药物主要包括 ４ 硝基咪唑 、 异丙硝唑 、 ２ 甲硝咪唑 、 洛硝哒唑 、 甲硝唑 、 氯甲硝咪唑 、 地美 硝唑 、 苯硝咪唑 ， 是一类抗菌素和抗原虫药 。 硝基咪唑类药物在体内吸收快 ， 所以标示残留物除了原形 药物外 ， 还包括代谢产物羟基甲硝唑 ＭＮＺＯＨ （ 甲硝唑代谢物 ）、 羟甲基甲硝咪唑 ＨＭＭＮＩ （ ２ 甲硝咪唑 、 洛硝哒唑代谢物 ）， 它们具有损害细菌 ＤＮＡ 和抗厌氧菌感染的功效 。 该类药物主要用于治疗和预防厌 氧菌引起的局部或系统感染 ， 抑制厌氧菌的 ＤＮＡ 合成 ， 也用于抗滴虫和阿米巴原虫等 。 由于硝基咪唑 类药物含有的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性 ， 从而导致此类药物有致癌作用和潜在的致畸作用 。 因此 ， 硝基咪唑类药物在大多数国家为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物 。 本标准提供了动物源食品中硝基咪唑类及代谢物的高效液相色谱 ／ 串联质谱多残留确证方法 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ２１３１８ — ２００７ 动物源食品中硝基咪唑残留量 检验方法 １ 　 范围 本标准规定了动物源性食品中硝基咪唑原药 ８ 种 、 代谢产物 ２ 种残留量的高效液相色谱 ／ 串联质谱 测定方法 。 本标准适用于猪肉 、 鸡肉 、 牛肉 、 猪肝 、 鸡肝 、 牛肝 、 猪肾 、 牛肾 、 鱼肉 、 奶粉 、 蜂蜜中 ： ４ 硝基咪唑 、 异丙 硝唑 、 ２ 甲硝咪唑 、 洛硝哒唑 、 甲硝唑 、 氯甲硝咪唑 、 地美硝唑 、 苯硝咪唑残留量及其代谢物羟基甲硝唑 ＭＮＺＯＨ （ 甲硝唑代谢物 ）、 羟甲基甲硝咪唑 ＨＭＭＮＩ （ ２ 甲硝咪唑 、 洛硝哒唑代谢物 ） 的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 原理 样品中残留的 ８ 种硝基咪唑 、 ２ 种代谢物用甲醇  丙酮均质或超声波提取 ， 经乙酸乙酯液液分配 ， 以 凝胶色谱 （ ＧＰＣ ） 净化 ， 再经固相萃取 （ ＳＰＥ ） 净化 ， 采用液相色谱 ／ 串联质谱确证 ， 外标法定量测定 。 ４ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 所有试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ２ 　 丙酮 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ３ 　 乙酸乙酯 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ４ 　 环己烷 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ５ 　 氯化钠 。 ４ ． ６ 　 无水硫酸钠 ： 经 ６５０℃ 灼烧 ４ｈ ， 贮于密封容器中备用 。 ４ ． ７ 　 甲酸 ： 优级纯 。 ４ ． ８ 　 饱和氯化钠水溶液 。 ４ ． ９ 　 硅藻土 ： ８０ 目 ～ １２０ 目 。 ４ ． １０ 　 Ｃ １８ 固相萃取柱 ： １．０ｇ ， ６ｍＬ 。 ４ ． １１ 　 微孔滤膜 ： 有机系 ， ０．４５ μ ｍ 。 ４ ． １２ 　 硝基咪唑原药 ８ 种 、 代谢产物 ２ 种标准物质 ： 纯度均大于等于 ９８％ （ 详见附录 Ａ ）。 ４ ． １３ 　 标准储备液 ： 分别准确称取适量的每种标准物质 ， 用甲醇配制成浓度为 １０００ μ ｇ ／ ｍＬ 的标准储 备液 。 该溶液应配制于棕色容量瓶中 ， 在 ０℃ ～ ４℃ 冰箱中可保存 １２ 个月 。 ４ ． １４ 　 混合中间标准溶液 ： 分别准确移取一定体积的每种标准储备液 ， 用甲醇稀释成适当浓度的混合中 间标准溶液 。 该溶液应配制于棕色容量瓶中 ， 在 ０℃ ～ ４℃ 冰箱中可保存 ６ 个月 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１３１８ — ２００７ ４ ． １５ 　 混合标准工作溶液 ： 分别准确移取一定体积的混合中间标准溶液 ， 可根据需要用甲醇稀释成适当 浓度的混合标准工作溶液 。 该溶液应配制于棕色容量瓶中 ， 在 ０℃ ～ ４℃ 冰箱中可保存 ３ 个月 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 液相色谱  串联质谱仪 ： 配电喷雾离子源串联四极杆检测器 。 ５ ． ２ 　 凝胶色谱仪 ： 配有馏份收集浓缩器 。 ５ ． ３ 　 组织捣碎机 。 ５ ． ４ 　 均质器 。 ５ ． ５ 　 超声波发生器 。 ５ ． ６ 　 旋转蒸发器 。 ５ ． ７ 　 高速离心机 。 ５ ． ８ 　 氮吹仪 。 ５ ． ９ 　 具塞锥型瓶 ： ２５０ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 分液漏斗 ： ２５０ｍＬ 。 ５ ． １１ 　 浓缩瓶 ： ５０ｍＬ 、 ２５０ｍＬ 。 ６ 　 试样制备与保存 ６ ． １ 　 肌肉组织及器脏组织类 、 水产品类 从原始样品中取出有代表性样品 （ 脏器应剔除筋膜 ） 约 ５００ｇ ， 用组织捣碎机充分捣碎混匀 ， 均分成 两份 ， 分别装入洁净的容器作为试样 ， 密封并标明标记 ， 将试样置于 －１８℃ 冷冻避光保存 。 ６ ． ２ 　 乳及乳制品类 从原始样品中取出有代表性样品约 ５００ｇ ， 用组织捣碎机充分捣碎混匀 ， 均分成两份 ， 分别装入洁净 的容器作为试样 ， 密封并标明标记 ， 将试样置于 ４℃ 冷藏避光保存 。 ６ ． ３ 　 蜂蜜 从原始样品中取出有代表性样品约 ２００ｇ ， 对无结晶的蜂蜜样品用组织捣碎机充分捣碎混匀 ， 均分 成两份 ， 分别装入洁净的容器作为试样 ， 密封并标明标记 ， 将试样置于 ４℃ 冷藏避光保存 ； 对有结晶析出 的蜂蜜样品 ， 在密闭情况下 ， 将样品瓶置于不超过 ６０℃ 的水浴中温热 ， 振荡 ， 待样品全部融化后用组织 捣碎机充分捣碎混匀 ， 均分成两份 ， 分别装入洁净的容器作为试样 ， 密封并标明标记 ， 将试样置于 ４℃ 冷 藏避光保存 。 在融化时应注意防止水分挥发 。 在制样的操作过程中 ， 应防止样品污染或残留物含量发生变化 。 ７ 　 样品处理 ７ ． １ 　 提取 ７ ． １ ． １ 　 肌肉组织 、 脏器组织样品及水产品 准确称取约 ２０ｇ 样品 （ 精确至 ０．１ｇ ） 于 ２５０ｍＬ 具塞锥形瓶中 ， 加入 １０ｇ 硅藻土 （ ４．９ ） 与样品充分 混匀 ， 再依次加入 ５ｍＬ 饱和氯化钠水溶液和 ７０ｍＬ 甲醇  丙酮 （ ３＋１ ）， 高速均质提取 ３ｍｉｎ 。 将提取液 移入离心管中 ， 于 １００００ｒ ／ ｍｉｎ 条件下离心 ２ｍｉｎ ， 将上层提取液移入 ２５０ｍＬ 浓缩瓶中 ， 残渣每次再用 ５０ｍＬ 甲醇  丙酮 （ ３＋１ ） 重复提取两次 ， 合并提取液 。 ７ ． １ ． ２ 　 蜂蜜 、 乳及乳制品样品 分别准确称取约 ２０ｇ 样品 （ 精确至 ０．１ｇ ） 于 ２５０ｍＬ 具塞锥形瓶中 ， 加入 １０ｍＬ 饱和氯化钠水溶 液和 ７０ｍＬ 甲醇  丙酮 （ ３＋１ ）， 超声波提取 ３０ｍｉｎ 。 移入离心管中 ， 于 １００００ｒ ／ ｍｉｎ 条件下离心 ２ｍｉｎ ， ２ 犌犅 ／ 犜 ２１３１８ — ２００７ 将上层提取液移入 ２５０ｍＬ 浓缩瓶中 。 残渣每次再用 ５０ｍＬ 甲醇  丙酮 （ ３＋１ ） 重复提取两次 ， 合并提 取液 。 ７ ． ２ 　 液液分配 将 ７．１．１ 和 ７．１．２ 所得提取液于 ４０℃ 水浴中旋转浓缩至只剩水相 ， 并转移至 ２５０ｍＬ 分液漏斗中 ， 加入 ５０ｍＬ 饱和氯化钠水溶液和 ２５ｍＬ 乙酸乙酯 ， 振摇 ３ｍｉｎ ， 静置分层 ， 收集乙酸乙酯相 。 水相再用 ２０ｍＬ 乙酸乙酯重复提取两次 ， 合并乙酸乙酯相 。 经无水硫酸钠柱脱水 ， 收集于 ２５０ｍＬ 浓缩瓶中 ， 于 ４０℃ 水浴中旋转浓缩至近干 ， 加入 ５ｍＬ 乙酸乙酯  环己烷 （ １＋１ ） 溶解残渣 ， 并用 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤 ， 待 净化 。 ７ ． ３ 　 净化 ７ ． ３ ． １ 　 凝胶色谱 （ 犌犘犆 ） 净化 ７ ． ３ ． １ ． １ 　 凝胶色谱净化条件 ａ ） 　 净化柱 ： ７００ｍｍ×２５ｍｍ ， ＢｉｏＢｅａｄｓＳＸ３ ， 或相当者 ； ｂ ） 　 流动相