书 书 书犐犆犛 ６７ ． １８０ ． １０ 犅 ４７ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７ 蜂蜜中泰乐菌素残留量的测定 液相色谱  串联质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狔犾狅狊犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犺狅狀犲狔 — 犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ３１ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、 中华人民共和国河南出入境检验检 疫局 。 本标准主要起草人 ： 吴斌 、 魏蔚 、 沈伟健 、 徐锦忠 、 陈惠兰 、 沈崇钰 、 赵增运 、 黄娟 、 蒋原 、 陶宏锦 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７ 蜂蜜中泰乐菌素残留量的测定 液相色谱  串联质谱法 １ 　 范围 本标准规定了蜂蜜中泰乐菌素 Ａ 残留量液相色谱  串联质谱测定方法提要 、 测定步骤和结果计算 。 本标准适用于蜂蜜中泰乐菌素 Ａ 残留量的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 方法提要 试样用碱性溶液溶解后 ， 泰乐菌素药物残留用固相萃取柱萃取 ， 洗脱液浓缩后用甲醇溶液定容 ， 液 相色谱  串联质谱仪测定 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 水 ： 应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． ２ 　 甲醇 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ３ 　 碳酸钠 ： 分析纯 。 ４ ． ４ 　 碳酸氢钠 ： 分析纯 。 ４ ． ５ 　 甲醇 ＋ 水 （ ２＋８ ）： 量取 ２０ｍＬ 甲醇 （ ４．２ ） 与 ８０ｍＬ 水混合 。 ４ ． ６ 　 固相萃取柱 ： ＨＬＢ 或相当者 ， ６０ｍｇ ， ３ｍＬ 。 ４ ． ７ 　 泰乐菌素 Ａ 标准 ： 纯度 ≥ ９５％ 。 ４ ． ８ 　 泰乐菌素 Ａ 标准储备溶液 ： １．０ｍｇ ／ ｍＬ 。 准确称取适量的泰乐菌素标准物质 （ ４．７ ）， 用甲醇配成 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 的标准储备液 。 储备液贮存在 ４℃ 冰箱中 ， 可使用两个月 。 ４ ． ９ 　 泰乐菌素 Ａ 标准工作溶液 ： 用空白样品提取液分别配成泰乐菌素浓度为 ２．０ｎｇ ／ ｍＬ 、 ５．０ｎｇ ／ ｍＬ 、 １０．０ｎｇ ／ ｍＬ 、 ５０．０ｎｇ ／ ｍＬ 、 １００．０ｎｇ ／ ｍＬ 、 ２００．０ｎｇ ／ ｍＬ 标准工作溶液 。 标准工作溶液在 ４℃ 保存 ， 可 使用一周 。 ４ ． １０ 　 Ｎａ ２ ＣＯ ３ ＮａＨＣＯ ３ 缓冲液 （ ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ５．３ｇ 碳酸钠和 ４．２ｇ 碳酸氢钠用适量水溶解后 ， 稀 释至 １０００ｍＬ 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 液相色谱  串联质谱仪 ： 配有电喷雾离子源 。 ５ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．１ｍｇ 和 ０．０１ｇ 各一台 。 ５ ． ３ 　 氮吹仪 。 ５ ． ４ 　 旋涡混匀器 。 ５ ． ５ 　 贮液器 ： ５０ｍＬ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７ ５ ． ６ 　 真空泵 ： 真空度应达到 ８０ｋＰａ 。 ５ ． ７ 　 移液器 ： １０ｍＬ 。 ５ ． ８ 　 离心管 ： ５０ｍＬ ， 具塞 。 ５ ． ９ 　 刻度离心管 ： １０ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 滤膜过滤器 ： ０．４５ μ ｍ ， 有机相 。 ６ 　 试样的制备与保存 ６ ． １ 　 试样制备 对无结晶的实验室样品 ， 将其搅拌均匀 。 对有结晶的样品 ， 在密闭情况下 ， 置于不超过 ６０℃ 的水浴 中温热 ， 振荡 ， 待样品全部融化后搅匀 ， 冷却至室温 。 分出 ０．５ｋｇ 作为试样 。 制备好的试样置于样品瓶 中 ， 密封 ， 并做上标记 。 ６ ． ２ 　 试样保存 将试样于常温状态下保存 。 注 ： 在取样和制样操作过程中 ， 应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 提取 称取 ５ｇ 试样 ， 精确到 ０．０１ｇ 。 置于 ５０ｍＬ 具塞离心管中 ， 加入 １０ｍＬ０．１ｍｏｌ ／ ＬＮａ ２ ＣＯ ３ ＮａＨＣＯ ３ 缓 冲溶液 ， 于液体混匀器上快速混合 １ｍｉｎ ， 使试样完全溶解 。 将混合液倒入下接 ＯａｓｉｓＨＬＢ 柱 （ ４．６ ） 的 贮液器中 ， 使用前分别用 ３ｍＬ 甲醇和 ５ｍＬ 水预处理 ， 保持柱体湿润 。 溶液以不高于 ２ｍＬ ／ ｍｉｎ 的流 速通过 ＯａｓｉｓＨＬＢ 固相萃取柱 ， 待溶液完全流出后 ， 用 ５ｍＬ 水洗离心管和贮液管并过柱 ， 然后再用 ５ｍＬ 甲醇 ＋ 水 （ ４．５ ） 洗柱 ， 弃去全部淋出液 。 在 ６５ｋＰａ 的负压下 ， 减压抽干 １０ｍｉｎ ， 最后用 ５ｍＬ 甲醇 （ ４．２ ） 洗脱 ， 收集洗脱液于 １０ｍＬ 刻度离心管 （ ５．９ ） 中 ， 于 ５０℃ 用氮气吹干仪吹干 ， 用甲醇 （ ４．２ ） ＋ 水 （ ４．１ ）（ ３０＋７０ ） 定容至 １．０ｍＬ ， 过 ０．４５ μ ｍ 的滤膜到进样瓶中 ， 供液相色谱  质谱仪测定 。 ７ ． ２ 　 测定 ７ ． ２ ． １ 　 液相色谱条件 ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ １８ ， ５ μ ｍ ， １５０ｍｍ×２．１ｍｍ （ 内径 ） 或相当者 ； ｂ ） 　 流动相 ： 水 （ Ａ ） ＋ 甲醇 （ Ｂ ）； ｃ ） 　 流速 ： ０．２５ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｄ ） 　 梯度 ： ０ｍｉｎ ～ ５．０ｍｉｎ２０％ ～ ９０％Ｂ ， ５．０ｍｉｎ ～ ７．０ｍｉｎ９０％Ｂ ， ７．１ｍｉｎ ～ ９．０ｍｉｎ２０％Ｂ ； ｅ ） 　 柱温 ： ３０℃ ； ｆ ） 　 进样量 ： ２５ μ Ｌ 。 ７ ． ２ ． ２ 　 串联质谱条件 ａ ） 　 离子源 ： 电喷雾离子源 （ ＥＳＩ ）， 正离子监测 ； ｂ ） 　 扫描方式 ： 选择离子检测 （ ＳＲＭ ）； ｃ ） 　 雾化气 、 鞘气为高纯氮气 ， 碰撞气为高纯氦气 ； ｄ ） 　 电喷雾电压 、 碰撞电压等自动优化至最佳值 ； ｅ ） 　 定性离子对 、 定量离子对和碰撞气能量见表 １ 。 表 １ 　 定性离子对 、 定量离子对和碰撞气能量 定性离子对 （ ｍ ／ ｚ ） 定量离子对 （ ｍ ／ ｚ ） 碰撞气能量 ／ ｅＶ ９１６．５ ／ １７４ ９１６．５ ／ ７７２．５９１６．５ ／ １７４ ３８ １６ ２ 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７ ７ ． ３ 　 液相色谱  串联质谱测定 泰乐菌素 Ａ 标准工作溶液 （ ４．９ ） 在液相色谱  质谱设定条件下分别进样 ， 以样品峰面积为纵坐标 ， 工作溶液浓度 （ ｎｇ ／ ｍＬ ） 为横坐标 ， 绘制 ６ 点标准工作曲线 ， 用标准工作曲线对样品进行定量 ， 样品溶液 中泰乐菌素的响应值均应在仪器测定的线性范围内 。 在上述色谱条件下 ， 泰乐菌素 Ａ 参考保留时间为 ６．５３ｍｉｎ 。 泰乐菌素标准物质色谱 、 质谱图分别参见图 Ａ．１ 、 图 Ａ．２ 。 ７ ． ４ 　 空白试验 除不称取试样外 ， 均按上述步骤进行 。 ８ 　 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式 （ １ ） 计算 ， 计算结果需扣除空白值 ： 犡 ＝ 犮 · 犞 犿 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犡 ——— 试样中被测组分残留量 ， 单位为微克每千克 （ μ ｇ ／ ｋｇ ）； 犮 ——— 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度 ， 单位为纳克每毫升 （ ｎｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 样品溶液定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 样品溶液所代表试样的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 ９ 　 检测低限和回收率 ９ ． １ 　 检测低限 本方法对蜂蜜中泰乐菌素 Ａ 残留量的检测低限为 １．０ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ９ ． ２ 　 回收率 蜂蜜中泰乐菌素 Ａ 添加浓度及平均回收率的试验数据 ： 在 １．０ μ ｇ ／ ｋｇ 时 ， 回收率范围为 ７８．４％ ～ １０７．８％ ； 在 ５．０ μ ｇ ／ ｋｇ 时 ， 回收率范围为 ７０．１％ ～ ８９．５％ ； 在 １０．０ μ ｇ ／ ｋｇ 时 ， 回收率范围为 ７７．２％ ～ １０１．１％ ； 在 ４０．０ μ ｇ ／ ｋｇ 时 ， 回收率范围为 ７３．４％ ～ ９４．８％ 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 标准物质总离子流图及质谱图 图 犃 ． １ 　 泰乐菌素 犃 标准物质总离子流图 ４ 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７ 图 犃 ． ２ 　 泰乐菌素 犃 标准物质质谱图 ５ 犌犅 ／ 犜 ２１１６８ — ２００７