书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ ． ９９ 犅 ４５ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１１６６ — ２００７ 肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱  串联质谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狀犻狋狉狅犳狌狉犪狀犿犲狋犪犫狅犾犻狋犲狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犮犪狊犻狀犵 — 犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ３１ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 陈惠兰 、 丁涛 、 沈崇钰 、 吴斌 、 徐锦忠 、 林宏 、 李公海 、 张扬 、 蒋原 、 蔡宝亮 、 陶宏锦 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１１６６ — ２００７ 肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱  串联质谱法 １ 　 范围 本标准规定了肠衣中呋喃它酮的代谢物 ５ 甲基吗啉 ３ 氨基 ２ /G21 唑烷基酮 （ 简称 ＡＭＯＺ ）、 呋喃西 林的代谢物氨基脲 （ 简称 ＳＥＭ ）、 呋喃妥因的代谢物 １ 氨基 ２ 内酰脲 （ 简称 ＡＨＤ ） 和呋喃唑酮的代谢物 ３ 氨基 ２ /G21 唑烷基酮 （ 简称 ＡＯＺ ） 残留量的液相色谱  串联质谱的测定方法 。 本标准适用于肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — １９９２ ， ｎｅｑＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ） ３ 　 方法提要 硝基呋喃类药物在动物体内迅速分解 ， 其原位稳定性只有数小时 ， 而其代谢物在动物体内容易和蛋 白组织结合 ， 十分稳定 。 在酸性条件下 ， 与蛋白质组织键合的硝基呋喃类药物代谢物游离出来 ， 与衍生 化试剂避光衍生化 １６ｈ ， 乙酸乙酯提取后 ， 浓缩定容 ， 用液相色谱  串联质谱仪测定 ， 内标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 水 ： 应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ４ ． ２ 　 甲醇 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ３ 　 乙酸乙酯 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ４ 　 乙酸铵 ： ＨＰＬＣ 级 。 ４ ． ５ 　 无水磷酸氢二钾 ： 分析纯 。 ４ ． ６ 　 二甲基亚砜 ： 分析纯 。 ４ ． ７ 　 邻硝基苯甲醛 ： 分析纯 。 ４ ． ８ 　 盐酸 ： ３６％ ～ ３８％ 分析纯 。 ４ ． ９ 　 同位素内标 ： ＡＨＤ １３ Ｃ３ ， ＡＭＯＺＤ５ ， ＡＯＺＤ４ ， ＳＥＭ · ＨＣｌ （ １３ Ｃ ， １５ Ｎ２ ）， １００ μ ｇ ／ ｍＬ ， 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １０ 　 ＡＯＺ 、 ＳＥＭ · ＨＣｌ 、 ＡＭＯＺ 和 ＡＨＤ · ＨＣｌ 标准品 ： 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． １１ 　 ＡＯＺ 、 ＳＥＭ 、 ＡＭＯＺ 和 ＡＨＤ 标准储备溶液 ： １ｍｇ ／ ｍＬ 。 准确称取适量的 ＡＯＺ 、 ＳＥＭ · ＨＣｌ 、 ＡＭＯＺ 和 ＡＨＤ · ＨＣｌ 标准品 （ ４．１０ ）， 用甲醇 （ ４．２ ） 配成 １．０ｍｇ ／ ｍＬ 的标准储备液 。 储备液贮存在 ４℃ 冰箱中 ， １ 年有效 。 ４ ． １２ 　 ＡＯＺ 、 ＳＥＭ 、 ＡＭＯＺ 和 ＡＨＤ 标准工作溶液 ： 用甲醇分别配成浓度为 １００ｎｇ ／ ｍＬ 、 １０ｎｇ ／ ｍＬ 标准 工作溶液 ， 标准工作溶液在 ４℃ 保存 ， ３ 个月有效 。 ４ ． １３ 　 内标溶液 ： 用甲醇配制浓度为 ５０ｎｇ ／ ｍＬ 四种内标混合溶液 ， 内标混合溶液在 ４℃ 保存 ， １ 年 有效 。 ４ ． １４ 　 衍生化溶液 ： ５０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 邻硝基苯甲醛 。 称取 ０．０３７８ｇ 的邻硝基苯甲醛 （ ４．７ ） 到 ５０ｍＬ 烧杯 １ 犌犅 ／ 犜 ２１１６６ — ２００７ 中 ， 加入 ５ｍＬ 二甲基亚砜 （ ４．６ ） 溶解 ， 现配 。 ４ ． １５ 　 磷酸氢二钾缓冲液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ８７．１ｇ 无水磷酸氢二钾 （ ４．５ ）， 加入 ５００ｍＬ 水溶解 。 ５ 　 仪器 ５ ． １ 　 液相色谱  串联质谱仪 （ 串联四极杆 ）： 配有电喷雾离子源 。 ５ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．０１ｇ 和 ０．１ｍｇ 各一台 。 ５ ． ３ 　 旋转蒸发仪或相当者 。 ５ ． ４ 　 水浴振荡器 。 ５ ． ５ 　 旋涡混匀器 。 ５ ． ６ 　 贮液器 ： ５０ｍＬ 。 ５ ． ７ 　 真空泵 ： 真空度应达到 ８０ｋＰａ 。 ５ ． ８ 　 离心机 。 ５ ． ９ 　 移液器 ： ５ｍＬ ， ２００ μ Ｌ 。 ５ ． １０ 　 离心管 ： ５０ｍＬ ， 具塞 。 ６ 　 试样的制备与保存 ６ ． １ 　 试样制备 将实验室样品绞碎均匀 ， 分出 ０．５ｋｇ 作为试样 。 制备好的试样置于样品袋中 ， 密封 ， 并做上标记 。 ６ ． ２ 　 试样保存 将试样于冷冻状态下保存 （ －１８℃ ）。 ７ 　 测定步骤 ７ ． １ 　 提取 准确称取 ２．００ｇ 试样 ， 置于 ５０ｍＬ 具塞离心管中 ， 准确加入 ０．１００ｍＬ５０ｎｇ ／ ｍＬ 四种内标混合溶 液 （ ４．１３ ）、 ４ｍＬ 水 、 ０．５ｍＬ１ｍｏｌ ／ ＬＨＣｌ 、 １５０ μ Ｌ 邻硝基苯甲醛溶液 （ ４．１４ ）， 于旋涡混匀器上快速混合 ３０ｓ ， ３７℃ 水浴振荡过夜 （ １６ｈ ）。 取出样品 ， 冷却到室温后 ， 加入 ３．５ｍＬ 磷酸氢二钾缓冲溶液 （ ４．１５ ）， 调节样品溶液 ｐＨ７ ～ ７．５ 。 加入 ８ｍＬ 乙酸乙酯 ， 混合 ３０ｓ ， ２５００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 取上层乙酸乙酯溶 液到 ５０ｍＬ 玻璃试管中 ， 再加入 ８ｍＬ 乙酸乙酯 ， 重复上述提取步骤 ， 合并提取液 ， ４０℃ 水浴旋转蒸发 干 。 用甲醇水溶液 （ ４＋６ ） １．０ｍＬ 定容 ， 过 ０．４５ μ ｍ 的滤膜到进样瓶中 ， 供液相色谱  串联质谱仪测定 。 ７ ． ２ 　 标准溶液的衍生化 分别准确移取 １００ｎｇ ／ ｍＬ 和 １０ｎｇ ／ ｍＬ 四种标准混合溶液 （ ４．１２ ） ０．２０ｍＬ 、 ０．１０ｍＬ 和 ０．０５０ｍＬ 到相应干净的 ５０ｍＬ 玻璃离心管中 ， 准确加入 ０．１００ｍＬ 四种标准内标混合溶液 （ ４．１３ ）、 ０．５ｍＬ１ｍｏｌ ／ Ｌ ＨＣｌ 、 １５０ μ Ｌ 邻硝基苯甲醛溶液 （ ４．１４ ）， 于旋涡混匀器上快速混合 ３０ｓ ， ３７℃ 水浴振荡过夜 （ １６ｈ ）。 按 照样品提取步骤处理 （ ７．１ ） 后 ， 供液相色谱  串联质谱仪测定 。 ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 参考液相色谱条件 ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ １８ ， ５ μ ｍ ， １５０ｍｍ×２．１ｍｍ （ 内径 ）， 或相当者 ； ｂ ） 　 流动相 ： 甲醇 （ Ａ ） ＋０．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸铵水溶液 （ Ｂ ）； ｃ ） 　 流速 ： ０．２５ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｄ ） 　 梯度洗脱程序 ： ０ｍｉｎ ～ ６．０ｍｉｎ２０％ ～ ６０％Ａ ， ６ｍｉｎ ～ ８ｍｉｎ６０％Ａ ， ８ｍｉｎ ～ ９ｍｉｎ６０％ ～ ８０％Ａ ， ９ｍｉｎ ～ ９．１ｍｉｎ８０％ ～ ２０％Ａ ， ９．１ｍｉｎ ～ １０．５ｍｉｎ２０％Ａ ； ｅ ） 　 柱温 ： 室温 ； ｆ ） 　 进样量 ： ２５ μ Ｌ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１１６６ — ２００７ ７ ． ３ ． ２ 　 串联质谱条件 ａ ） 　 离子源 ： 电喷雾离子化电离源 （ ＥＳＩ ）， 正离子监测 ； ｂ ） 　 扫描方式 ： 选择离子检测 （ ＳＲＭ ）； ｃ ） 　 雾化气 、 鞘气为高纯氮气 ， 碰撞气为高纯氦气 ； ｄ ） 　 喷雾电压 、 碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度 ； ｅ ） 　 选择离子对见表 １ 。 表 １ 　 选择离子对 测定物质母离子 （ ｍ ／ ｚ ） 子离子 （ ｍ ／ ｚ ） ＡＯＺ ２３６．０１３４．０ ａ １０４．０ ＡＯＺＤ４ ２４０．０ １３４．０ ａ ＳＥＭ ２０９．０１６６．０ ａ １９２．０ ＳＥＭ （ １３ Ｃ ， １５ Ｎ２ ） ２１２．０ １６８．０ ａ ＡＨＤ ２４９．０１３４ ａ １７８ ＡＨＤ １３ Ｃ３ ２５２．０ １３４ ａ ＡＭＯＺ ３３５．０２９１ ａ ２６２ ＡＭＯＺＤ５ ３４０．０ ２９６．０ ａ ａ 　 定量离子 。 ７ ． ３ ． ３ 　 液相色谱  串联质谱测定 衍生化后的标准工作溶液 （ ７．２ ） 在液相色谱  串联质谱设定条件下分别进样 ， 以标准与内标物峰面 积比值为纵坐标 ， 工作溶液浓度 （ ｎｇ ／ ｍＬ ） 为横坐标 ， 绘制 ６ 点标准工作曲线 （ ０．５ｎｇ ／ ｍＬ ～ ２０ｎｇ ／