书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 　 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１１０２ — ２００７ 动物源性饲料中兔源性成分定性 检测方法 　 实时荧光 犘犆犚 方法 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犪犫犫犻狋犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊犻狀犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犪狋犲犱犳犲犲犱狊狋狌犳犳狊 — 犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ２４ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准主要起草单位 ： 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、 宝生物工程 （ 大连 ） 有限公司 、 中国 检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、 中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局 、 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 郑秋月 、 李晶泉 、 王玉萍 、 徐昊 、 曹际娟 、 于爱丽 、 张舒亚 、 陈颖 、 徐宝梁 、 高宏伟 、 宗卉 、 金东权 。 本标准首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１１０２ — ２００７ 动物源性饲料中兔源性成分定性 检测方法 　 实时荧光 犘犆犚 方法 １ 　 范围 本标准规定了动物源性饲料中兔源性成分实时荧光 ＰＣＲ 检测方法 ， 该检测方法的检出限为 ０．１％ 。 本标准适用于动物源性饲料中兔源性成分的定性检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 （ ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ — ２００５ ， ＩＳＯ６４９７ ： ２００２ ， ＩＤＴ ） ＳＮ ／ Ｔ１１９３ 　 基因检验实验室技术要求 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 实时荧光 犘犆犚 　 狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚 实时荧光聚合酶链式反应 。 ３ ． ２ 犆狋 值 　 犮狔犮犾犲狋犻犿犲 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ４ 　 原理 采用 ＴａｑＭａｎ 实时荧光 ＰＣＲ 技术 ， 根据线粒体 ＤＮＡ 的细胞色素 Ｃ 氧化酶亚单位 Ｉ （ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ ｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔＩ ， ＣＯＸＩ ） 基因上动物种间多态性的差异而进行兔源性成分鉴定 。 利用裂解液破碎细 胞 ， 三氯甲烷抽提蛋白质 ， 异丙醇沉淀得到 ＤＮＡ ； 以提取的 ＤＮＡ 为模板进行实时荧光 ＰＣＲ 扩增 。 本 标准应用多色荧光检测技术 ， 采用多重 ＰＣＲ 方法 ， 将所用试剂配制成预混合形式 ， 组建成实时荧光 ＰＣＲ 兔 ＤＮＡ 检测试剂盒 。 对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测 ， 在同一反应管 内对兔的 ＣＯＸＩ 基因及内参照基因同时进行扩增 ， 并通过标记两种不同荧光物质 ６ 羧基荧光素 （ ６ｃａｒ ｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ， ＦＡＭ ）、 ５ 六氯荧光素 （ ５ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ， ＨＥＸ ） 的探针进行特异性杂交 ， 两色荧 光同步检测 。 其中 ， 对内参照反应的检测 ， 可以监控反应是否正常进行 ， 防止假阴性结果 。 观察实时荧 光 ＰＣＲ 的增幅曲线 ， 从而对饲料中兔源性成分进行快速检测 。 ５ 　 试剂与材料 除另有规定外 ， 试剂为分析纯或生化试剂 ， 实验用水符合 ＧＢ６６８２ 的要求 。 ５ ． １ 　 犇犖犃 提取用试剂 ５ ． １ ． １ 　 三氯甲烷 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２１１０２ — ２００７ ５ ． １ ． ２ 　 异戊醇 。 ５ ． １ ． ３ 　 异丙醇 。 ５ ． １ ． ４ 　 ７０％ 乙醇 。 ５ ． １ ． ５ 　 裂解液 ： １％ＣＴＡＢ （ ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ， 十六烷基三甲基溴化铵 ）， ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．０ ）［ Ｔｒｉｓ ： ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ， 三 （ 羟甲基 ） 氨基甲烷 ］， ０．７ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ ， ０．０１ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ （ ｐＨ８．０ ）（ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ， 乙二胺四乙酸 ）。 ５ ． １ ． ６ 　 ＴＥ 缓冲液 （ ＴｒｉｓＨＣｌ 、 ＥＤＴＡ 缓冲液 ）： １０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．０ ）， １ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ （ ｐＨ８．０ ）。 ５ ． ２ 　 实时荧光 犘犆犚 兔 犇犖犃 检测试剂盒 ５ ． ２ ． １ 　 ２× 兔源性检测预混合液 ： 含有 Ｅｘ 犜犪狇 ＨＳ （ 终浓度 １．２５Ｕ ／ ２５ μ Ｌ ）、 ｄＮＴＰｓ （ 终浓度各 ０．４ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）、 Ｍｇ ２＋ （ 终浓度 ３ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）。 ５ ． ２ ． ２ 　 兔源性检测引物混合液 ： 含有扩增兔基因组 ＤＮＡ 及内参照的引物 （ 序列详见表 １ ）、 内参照 （ λ ＤＮＡ ）。 各引物终浓度 ０．１ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ～ １．０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 。 表 １ 　 兔及内参照引物序列 名 　 称 序 　　 列 兔 ５′ 引物 ５′ＴＡＡＴＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣ３′ 兔 ３′ 引物 ５′ＣＴＡＴＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＡＴＴＡＴＣＡ３′ 内参照 ５′ 引物 ５′ＧＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＴＴＡ３′ 内参照 ３′ 引物 ５′ＧＣＧＧＧＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＣ３′ ５ ． ２ ． ３ 　 兔源性检测探针混合液 ： 检测兔基因组 ＤＮＡ 的探针及检测内参照的探针 （ 序列详见表 ２ ）。 探 针浓度与使用的实时荧光 ＰＣＲ 扩增仪 、 荧光标记物质种类有关 ， 实际使用时请参照仪器说明书 ， 或各荧 光探针的具体使用要求进行 。 表 ２ 　 兔及内参照探针序列 名 　 称 序 　　 列 兔探针 ５′ （ ＦＡＭ ） ＡＣＡＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡ３′ （ Ｅｃｌｉｐｓｅ ） 内参照探针 ５′ （ ＨＥＸ ） ＣＣＧＣＣＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＴ３′ （ Ｅｃｌｉｐｓｅ ） ５ ． ２ ． ４ 　 阳性对照 ： 用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照 。 ５ ． ２ ． ５ 　 双蒸水 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 实时荧光 ＰＣＲ 检测系统 。 ６ ． ２ 　 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 ６ ． ３ 　 电子天平 ： 感量 ０．０１ｇ 。 ６ ． ４ 　 离心机 ： 离心力 １２０００ 犵 。 ６ ． ５ 　 微量移液器 ： ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ６ ． ６ 　 实时荧光 ＰＣＲ 反应管 。 ６ ． ７ 　 恒温水浴箱 。 ７ 　 试样选取与制备 按照 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 采样 ， 将实验室样品粉碎 ， 充分混合均匀后待用 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１１０２ — ２００７ ８ 　 检验步骤 ８ ． １ 　 样品的总 犇犖犃 提取 称取适量饲料 （ 饲料粒度为 １００ 目称取 ５０ｍｇ ； ６０ 目称取 １００ｍｇ ； ２０ 目称取 ２００ｍｇ ） 于 １．５ｍＬ 离 心管中 ， 加入 ６００ μ Ｌ ～ ８００ μ Ｌ 裂解液 ， ６５℃３０ｍｉｎ ， 每隔 １０ｍｉｎ 振荡混匀 ； １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 吸 取上清液至一新离心管中 ， 加 ４００ μ Ｌ 三氯甲烷 ＋ 异戊醇 （ ２４＋１ ）， 充分混匀 ； １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 吸取上清液至一新离心管中 ， 加 ０．８ 倍体积异丙醇 ， 室温下沉淀 １ｈ ～ ２ｈ ； １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃 上清液 ； ７０％ 乙醇洗涤一次 ， 晾干 ； 加入 ５０ μ ＬＴＥ ， 溶解沉淀 。 也可用等效的 ＤＮＡ 提取试剂盒提取模板 ＤＮＡ 。 ８ ． ２ 　 犇犖犃 浓度和纯度的测定 取 ５ μ ＬＤＮＡ 溶液加双蒸水稀释至 １ｍＬ ， 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测 ２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 处的吸光值 犃 ２６０ 和 犃 ２８０ 。 ＤＮＡ 的浓度按式 （ １ ） 计算 ： 犮 ＝ 犃 × 犖 × ５０ ／ １０００ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犮 ——— ＤＮＡ 浓度 ， 单位为微克每微升 （ μ ｇ ／ μ Ｌ ）； 犃 ——— ２６０ｎｍ 处的吸光值 ； 犖 ——— 核酸稀释倍数 。 当 犃 ２６０ ／ 犃 ２８０ 比值在 １．７ ～ １．９ 之间时 ， 适宜于 ＰＣＲ 扩增 。 ８ ． ３ 　 实时荧光 犘犆犚 检测 ８ ． ３ ． １ 　 反应体系的体积为 ２５ μ Ｌ ， ２× 兔源性检测预混合液加 １