书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２１１００ — ２００７ 动物源性饲料中骆驼源性成分 定性检测方法 　 犘犆犚 方法 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犪犿犲犾犻犱犪犲犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊犻狀犪狀犻犿犪犾 狅狉犻犵犻狀犪狋犲犱犳犲犲犱狊狋狌犳犳狊 — 犘犆犚犿犲狋犺狅犱 ２００７  １０  ２４ 发布 ２００８  ０４  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、 中华人民共 和国山东出入境检验检疫局 、 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 陈颖 、 吴亚君 、 徐宝梁 、 王晶 、 曹际娟 、 高宏伟 、 宗卉 、 黄文胜 、 袁飞 、 赵贵明 。 本标准首次发布 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２１１００ — ２００７ 动物源性饲料中骆驼源性成分 定性检测方法 　 犘犆犚 方法 １ 　 范围 本标准规定了动物源性饲料中骆驼 （ Ｃａｍｅｌｉｄａｅ ） 源性成分检测的 ＰＣＲ 方法 ， 该检测方法的检出限 为 ０．１％ （ 质量分数 ）。 本标准适用于动物源性饲料中骆驼源性成分的定性检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 （ ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ — ２００５ ， ＩＳＯ６４９７ ： ２００２ ， ＩＤＴ ） ＳＮ ／ Ｔ１１９３ 　 基因检验实验室技术要求 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 　　 聚合酶链式反应 　 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ； 犘犆犚 用于扩增位于两段已知序列之间的 ＤＮＡ （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅａａｃｉｄ ， 脱氧核糖核酸 ） 的方法 。 模板 ＤＮＡ 经过高温变性成单链 ， 在 ＤＮＡ 聚合酶和适宜的温度下 ， 两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分 别与模板 ＤＮＡ 两条链上的一段互补序列发生退火 ， 接着在 ＤＮＡ 聚合酶的催化下以 ４ 种 ｄＮＴＰ （ ｄｅ ｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ， 脱氧核苷酸三磷酸 ） 为底物 ， 使退火引物得以延伸 ， 如此反复变性 、 退火 和 ＤＮＡ 合成这一循环 ， 使位于两段已知序列之间的 ＤＮＡ 片段呈几何倍数扩增 ， 经 ２５ 个 ～ ３０ 个扩增 循环 ， 扩增倍数达到约 １０ ６ 。 ４ 　 原理 利用裂解液破碎细胞 ， 三氯甲烷抽提蛋白质 ， 无水乙醇沉淀得到 ＤＮＡ ； 以提取的 ＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增 ， 琼脂糖凝胶电泳检测 ＰＣＲ 扩增产物 ； ＰＣＲ 阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证 。 ５ 　 试剂和材料 除另有规定外 ， 试剂为分析纯或生化试剂 。 实验用水符合 ＧＢ６６８２ 的要求 。 ５ ． １ 　 骆驼源性成分检测用引物 （ 对 ） 序列为 ： Ｆ ： ５ ’ ＡＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＴＣＧＣＡＣＡＣ３ ’ Ｒ ： ５ ’ ＧＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴ３ ’ ５ ． ２ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ 犜犪狇 ， 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌 ， 水生栖热菌 ）。 ５ ． ３ 　 限制性内切酶 ： 犜犪狇 Ｉ 酶 。 ５ ． ４ 　 ｄＮＴＰｓ ： ｄＡＴＰ （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ， 脱氧腺苷三磷酸 ）、 ｄＴＴＰ （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓ １ 犌犅 ／ 犜 ２１１００ — ２００７ ｐｈａｔｅ ， 脱氧胸苷三磷酸 ）、 ｄＣＴＰ （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ， 脱氧胞苷三磷酸 ）、 ｄＧＴＰ （ ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ， 脱氧鸟苷三磷酸 ）。 ５ ． ５ 　 琼脂糖 ： 电泳纯 。 ５ ． ６ 　 溴化乙锭 。 ５ ． ７ 　 三氯甲烷 。 ５ ． ８ 　 无水乙醇 。 ５ ． ９ 　 ７０％ 乙醇 。 ５ ． １０ 　 ＤＮＡ 分子量标准品 （ １００ｂｐ ～ ６００ｂｐ ）（ ｂｐ ： ｂａｓｅｐａｉｒ ， 碱基对 ）。 ５ ． １１ 　 裂解液 ： １％ＣＴＡＢ （ ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ， 十六烷基三甲基溴化铵 ）， ０．０５ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ （ ｐＨ８．０ ）［ Ｔｒｉｓ ： ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ， 三 （ 羟甲基 ） 氨基甲烷 ］， ０．７ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ０．０１ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ （ ｐＨ８．０ ）（ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ， 乙二胺四乙酸 ）。 ５ ． １２ 　 ＴＥ 缓冲液 （ ＴｒｉｓＨＣｌ 、 ＥＤＴＡ 缓冲液 ）： １０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．０ ）， １ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ （ ｐＨ ８．０ ）。 ５ ． １３ 　 １０×ＰＣＲ 缓冲液 ： １００ｍｍｏｌ ／ ＬＫＣｌ ， １６０ｍｍｏｌ ／ Ｌ （ ＮＨ ４ ） ２ ＳＯ ４ ， ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＭｇＳＯ ４ ， ２００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．８ ）， １％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ （ ｔｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ ， 辛基苯氧基聚乙氧乙醇 ）， １ｍｇ ／ ｍＬＢＳＡ （ ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ ， 牛血清蛋白 ）。 ５ ． １４ 　 电泳缓冲液 ： Ｔｒｉｓ５４ｇ ， 硼酸 ２７．５ｇ ， ０．５ｍｏｌ ／ ＬＴＥ 缓冲液 （ ｐＨ８．０ ） ２０ｍＬ ， 加蒸馏水至 １０００ｍＬ ； 使用时 １０ 倍稀释 。 ５ ． １５ 　 溴化乙锭贮存液 ： 用水配制成 １０ｍｇ ／ ｍＬ 。 ５ ． １６ 　 加样缓冲液 ： ０．２５％ 溴酚蓝 ， ４０％ （ 质量浓度 ） 蔗糖水溶液 。 ５ ． １７ 　 酶切缓冲液 ： １０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ７．５ ）， １０ｍｍｏｌ ／ ＬＭｇＣｌ ２ ， ５０ｍｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ０．１ｍｇ ／ ｍＬＢＳＡ 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 ＤＮＡ 热循环仪 。 ６ ． ２ 　 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 ６ ． ３ 　 恒温水浴锅 。 ６ ． ４ 　 离心机 ： 离心力 １２０００ 犵 。 ６ ． ５ 　 微量移液器 （ ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）。 ６ ． ６ 　 电泳仪 。 ６ ． ７ 　 紫外检测仪 。 ６ ． ８ 　 ｐＨ 计 。 ６ ． ９ 　 天平 ： 感量 ０．０１ｇ 。 ７ 　 试样选取与制备 按照 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 采样 ， 将实验室样品粉碎 ， 充分混合均匀后待用 。 ８ 　 检验步骤 ８ ． １ 　 样品的总 犇犖犃 提取 样品粒度 １００ 目时最少称取 ５０ｍｇ ； ６０ 目时最少称取 １００ｍｇ ； ２０ 目时最少称取 ２００ｍｇ 。 称取样品于微量离心管中 ， 加入 ６００ μ Ｌ ～ ８００ μ Ｌ 裂解液 ， ６５℃３ｈ ， 期间不时振荡混匀 ； １２０００ 犵 离 心 ５ｍｉｎ ， 转移上清于洁净离心管中 ， 加等体积酚 ， 混匀 ； １２０００ 犵 离心 ５ｍｉｎ ， 转移上清于洁净离心管 中 ， 加等体积三氯甲烷 ＋ 异戊醇 （ ２４＋１ ）， 混匀 ； １２０００ 犵 离心 ５ｍｉｎ ， 取上清液 ； 加 ２ 倍体积冰预冷的无 水乙醇 ， －２０℃ 沉淀 １ｈ ； １２０００ 犵 离心 ５ｍｉｎ ， 弃上清液 ； ７０％ 乙醇洗涤一次 ， 晾干 ； 加入 ５０ μ ＬＴＥ ， 溶解 ２ 犌犅 ／ 犜 ２１１００ — ２００７ 沉淀 。 也可用等效 ＤＮＡ 提取试剂盒提取模板 ＤＮＡ 。 ８ ． ２ 　 犇犖犃 浓度和纯度的测定 取 ５ μ ＬＤＮＡ 溶液加双蒸水稀释至 １ｍＬ ， 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 ２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 处的吸光值 犃 ２６０ 和 犃 ２８０ 。 ＤＮＡ 的浓度按式 （ １ ） 计算 ： 犮 ＝ 犃 × 犖 × ５０ ／ １０００ ……………………（ １ ） 　　 式中 ： 犮 ——— ＤＮＡ 浓度 ， 单位为微克每微升 （ μ ｇ ／ μ Ｌ ）； 犃 ——— ２６０ｎｍ 处的吸光值 ； 犖 ——— 核酸稀释倍数 。 当 犃 ２６０ ／ 犃 ２８０ 比值在 １．７ ～ １．９ 之间时 ， 适宜于 ＰＣＲ 扩增 。 ８ ． ３ 　 犘犆犚 扩增 ５０ μ Ｌ 反应体系 ： １０×ＰＣＲ 缓冲液